一种菠萝泛菌的PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种菠萝泛菌的PCR检测方法，以菠萝泛菌的基因组DNA作为PCR反应模板进行PCR反应；PCR反应体系为：10×PCR Buffer2.5μL；10mM dNTP 1.0μL；10mM上游引物PanITS2‑1F 1.0μL；10mM下游引物PanITS2‑1R 1.0μL；模板DNA 1.0μL；2.5U/mL Taq酶0.5μL；ddH2O 18.0μL；反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火15s，72℃延伸25S，25个循环。本发明专利技术能够快速特异准确的检测到植株材料中的菠萝泛菌，为玉米细菌斑点病的早期诊断、检疫和病害的早期预警提供了一种方法，也可为该菌株在其他环境中的快速检测提供一种方法。

A PCR detection method for pineapple pineapple

The invention discloses a PCR detection method for pineapple pineapple (pineapple pineapple), which takes the genome DNA of pineapple pineapple as a PCR reaction template for PCR reaction, and the PCR reaction system is 10 * PCR Buffer2.5 mu L, 10mM dNTP 1 mu L; the upstream primers are 1 mu; the downstream primers are 1 micron; 1 Taq enzyme 0.5 mu L; ddH2O 18.0 mu L; reaction conditions are: pre-denaturation at 94 C for 3 min, denaturation at 94 C for 30 s, annealing at 50 C for 15 s, extension at 72 C for 25 s, 25 cycles. The invention can quickly and accurately detect pineapple pineapple in plant material, providing a method for early diagnosis, quarantine and early warning of corn bacterial spot disease, and also provides a method for rapid detection of the strain in other environment.

【技术实现步骤摘要】
一种菠萝泛菌的PCR检测方法
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种菠萝泛菌的PCR检测方法。
技术介绍
植物病原细菌Pantoeaananatis(Serrano1928)，属原核生物界Procaryotae，薄壁菌门Gracilicutes，变形菌纲Gammaproteobacteria，肠杆菌科Enterobacteriaceae。自1928年首次在菲律宾报道P.ananatis引起菠萝的果实腐烂以来，已经发现P.ananatis是包括单子叶植物和双子叶植物在内的很多植物的病原菌，在适宜的环境条件下会引起寄主植物的突发性病害，P.ananatis在自然界的分布很广，它不仅是植物的共生细菌、内生细菌、致病菌，还在不同的生态小环境(ecologicalniches)中起不同寻常的作用，例如有报道称它可以作为腐生菌。已报道P.ananatis至少在11个国家引起10多种植物的病害，造成严重的经济损失。P.ananatis可以导致总叶面积50％或更多的叶片萎蔫；可以致使洋葱产量损失达到100％；而被P.ananatis严重侵染的玉米叶片干枯，进而导致果实的重量和体积严重减少；被P.ananatis感染的桉树死亡或产生多干现象，很多不同的桉树品种都可以被P.ananatis侵染。P.ananatis还可以导致哈密瓜、白兰瓜和洋葱收获后果实的腐烂。已知P.ananatis的传播方式有通过花或昆虫、机械等造成的伤口侵染，以及在大风中植物与植物之间的接触传播。研究发现洋葱、苏丹草和水稻种子可以携带并传播P.ananatis。另外，P.ananatis引起不同植物感病的严重程度受到环境因素的影响。如果寄主植物是桉树和玉米，气候温暖(温度在20-25℃)和高湿度条件下发病率高且危害严重。如果寄主是苏丹草，发病的最适条件为温度32℃和高湿度；寄主为洋葱，发病的最适条件在温度为28-35℃，高湿度的条件下，洋葱球茎的形成过程中，可以分离到大量的P.ananatis。玉米是我国三大粮食作物之一，近年来我国玉米的种植面积稳居第一位。随着全球气候变化、耕作方式改变和新品种推广，我国玉米病害的发生也有所改变，一些病原细菌引起的叶斑病有逐年加重发生的趋势，感病品种既涉及普通玉米，也涉及甜糯玉米。其中，由植物病原细菌菠萝泛菌P.ananatis引起的玉米细菌性斑点病，在我国的主要玉米产区呈上升趋势，该病可以造成玉米叶片大面积枯死。玉米细菌性斑点病具有传播快，发病快、难防控的特点，对玉米生产造成了很大的损失。目前，还没用一种可以直接从植物材料等组织或环境中，快速特异准确的检测到P.ananatis的方法。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种菠萝泛菌的PCR检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种菠萝泛菌的PCR检测方法，其特征在于，以菠萝泛菌的基因组DNA作为PCR反应模板进行PCR反应；PCR反应体系为：10×PCRBuffer2.5μL；10mMdNTP1.0μL；10mM上游引物PanITS2-1F1.0μL；10mM下游引物PanITS2-1R1.0μL；模板DNA1.0μL；2.5U/mLTaq酶0.5μL；ddH2O18.0μL；反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火15s，72℃延伸25S，25个循环；所述上游引物PanITS2-1F为：5’-TCGCCTGATTATACAATCTCACCTTCA-3’；所述下游引物PanITS2-1R为：5’-GTGGGTTGTGAGGTTAAGCGACTAA-3’。本专利技术是根据菠萝泛菌Pantoeaananatis的ITSrDNA序列中的一条537bp的序列，设计了该菌株的特异性引物对PanITS2-1F/PanITS2-1R，该引物可以将菠萝泛菌与其他植物病原细菌区分开，基于该引物开发的PCR检测方法可以用于菠萝泛菌的快速检测，该方法能够快速特异准确的检测到植株材料中的菠萝泛菌，为玉米细菌斑点病的早期诊断、检疫和病害的早期预警提供了一种方法，也可为该菌株在其他环境中的快速检测提供一种方法。附图说明图1为菌株YB022、YB102ITSrDNA扩增结果；图中：M:100bpDNAmarker；泳道1:YB022；泳道2:YB102图2为PCR扩增鉴定重组质粒结果；图中：M:100bpDNAmarker；泳道1、2:YB022692bp片段的重组质粒；3、4:YB022466bp片段的重组质粒；5、6:YB022537bp片段的重组质粒；7-9：YB102692bp片段的重组质粒；10:蓝斑；11:阴性对照图3为在ITS-2上设计特异性引物。图4为PCR扩增检测引物特异性结果；图中：M:100bpDNAmarker；1:YB022；2:P.agglomerans；3:P.agglomerans；4：E.amylovora；5:E.amylovora；6:Cmn；7:A.avenae；8:S.maltophilia；9P.syringae；10E.carotovoravar.carotovora；11B.subtilis12:control。图5为特异性引物扩增YB022菌悬液的灵敏度图中：M:100bpDNAmarker；1-7浓度依次为：2×109～2×103CFU/mL；8:阴性对照。图6为特异性引物扩增YB022基因组DNA的灵敏度；图中：M:100bpDNAmarker；1-5浓度依次为:160ng/μL～0.016ng/μL；6:1.6pg/μL；7:0.16pg/μL；8:阴性对照。图7为特异性引物扩增供试菌株；图中：M:D2000DNAmarker；泳道1-14:YB022、YB037、YB059、YB060、YB061、YB062、YB084、YB094、YB104、YB106、YB107、YB113、YB114、YB151。具体实施方式为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1菌株rDNA-ITS的扩增及测序1材料与方法1.1供试菌株YB022及33株其它对照菌株(表1)1.2细菌基因组DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)，购于天根生化科技(北京)有限公司。1.3细菌ITS序列扩增采用细菌ITS通用引物L1/L2对供试菌株的ITS序列进行扩增。L1：5'-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3'L2：5'-GTGCCAAGGCATCCACC-3'引物序列由上海生工生物程技术服务有限公司合成。1.4ITS序列PCR扩增体系及条件取6μl扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为2％，电泳缓冲液为1×TBE，恒定电压为150V，电泳30min。取出凝胶放进凝胶成像设备检测PCR产物。(1)PCR反应体系(2)PCR反应条件1.5ITS序列PCR产物克隆1.5.1PCR产物的纯化与回收从琼脂糖凝胶上切取目标片段，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购于天根生化科技(北京)有限公司，纯化与回收目标片段。1.5.2PCR产物与载体的连接回收纯化的PCR产物与pGEM-TEasy质粒载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菠萝泛菌的PCR检测方法，其特征在于，以菠萝泛菌的基因组DNA作为PCR反应模板进行PCR反应；PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2.5μL；10mM dNTP 1.0μL；10mM上游引物PanITS2‑1F 1.0μL；10mM下游引物PanITS2‑1R 1.0μL；模板DNA 1.0μL；2.5U/mL Taq酶0.5μL；ddH2O 18.0μL；反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火15s，72℃延伸25S，25个循环；所述上游引物PanITS2‑1F为：5’‑TCGCCTGATTATACAATCTCACCTTCA‑3’；所述下游引物PanITS2‑1R为5’‑GTGGGTTGTGAGGTTAAGCGACTAA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种菠萝泛菌的PCR检测方法，其特征在于，以菠萝泛菌的基因组DNA作为PCR反应模板进行PCR反应；PCR反应体系为：10×PCRBuffer2.5μL；10mMdNTP1.0μL；10mM上游引物PanITS2-1F1.0μL；10mM下游引物PanITS2-1R1.0μL；模板DNA1.0μL；2.5U/mLTaq酶0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：司丙文，张小利，屠焰，王晓鸣，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11