重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用，涉及基因工程领域。该基因工程菌的构建方法包括以下步骤：将来源于虫拟蜡菌的草酸氧化酶基因按照里氏木霉的密码子偏好性进行优化，得到草酸氧化酶的优化基因；敲除里氏木霉基因组中的pyr4基因和mus53基因，构建里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株；采用草酸氧化酶的优化基因构建重组表达载体；采用重组表达草酸氧化酶的载体，转化里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株，得到重组表达草酸氧化酶的基因工程菌。本发明专利技术的基因工程菌能够高效表达具有天然活性的草酸氧化酶，适用于研发重组草酸氧化酶药物、生产低草酸食品及饮料。

Recombinant engineering bacteria expressing oxalate oxidase and its construction method and Application

The invention discloses a recombinant gene engineering bacteria expressing oxalate oxidase, a construction method and application thereof, and relates to the field of gene engineering. The construction method of the gene engineering bacteria includes the following steps: in the future, the oxalate oxidase gene derived from the parasitic wax bacteria is optimized according to the codon preference of Trichoderma richers, and the optimized gene for oxalic acid oxidase is obtained. The pyr4 gene and the mus53 gene in the genome of Trichoderma Richter are knocked out, and the pyr4 and mus53 genes of Trichoderma Richter are constructed. The recombinant expression vector was constructed with the optimized gene of oxalate oxidase, and the recombinant expression vector of oxalate oxidase was used to transform the mutant strain of Trichoderma reei pyr4 gene and mus53 gene to obtain recombinant gene engineering bacteria expressing oxalate oxidase. The genetic engineering bacteria of the invention can efficiently express oxalic acid oxidase with natural activity, which is suitable for the development of recombinant oxalate oxidase, production of low oxalic acid food and beverage.

【技术实现步骤摘要】
重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
草酸(oxalicacid)，即乙二酸，分子式为H2C2O4，广泛存在于自然界中，常以草酸盐形式存在于植物如伏牛花、羊蹄草、酢浆草和酸模草的细胞膜，几乎所有的植物都含有草酸盐。在某些食物(如菠菜，绿茶，咖啡等)中含量很高。草酸在生物体内为最终产物，不能被进一步分解，主要排泄方式是随尿液一起排出。人体中的草酸包括外源性草酸和内源性草酸，外源性草酸是指通过饮食摄入的草酸，内源性草酸是指人体自身代谢产生的草酸，正常人体内的外源性草酸和内源性草酸含量基本相同。某些肾结石高发人群的外源性草酸远远大于内源性草酸。人体内血液和尿液中的草酸含量过高时，容易与钙离子形成不溶性的草酸钙晶体，而这些草酸钙晶体极易在膀胱、肾脏等器官内沉积形成结石。II型高草酸尿症是指食源性草酸吸收异常，导致尿草酸比正常人偏高，是除原发性高草酸尿症外导致结石的重要因素，因此，控制从饮食中摄取的草酸，很大程度上就可以降低尿草酸含量，从而降低患结石的风险。低草酸饮食或降解食物中的草酸是防治草酸钙结石最重要策略，目前在医学界已达成共识。目前，已发现的能分解草酸的酶有草酸氧化酶、草酸脱羧酶和草酰辅酶A脱羧酶/甲酰辅酶A转移酶。草酸氧化酶(OxalateOxidase，以下简称OxOx)能专一性地将草酸分解为CO2和H2O2，因此在诊断和治疗与草酸相关的疾病方面有着潜在的应用价值。草酸氧化酶虽然广泛存在于植物体内，但含量较低且提取纯化工艺复杂。草酸氧化酶在其他微生物(毕赤酵母、芽孢杆菌等)表达宿主中的表达水平也普遍不高，在原核表达系统E.coli中可以表达但不可溶，需要清洗包涵体，纯化，复性，程序繁琐。因此，开发产量高、安全性高、发酵提纯工艺简单、成本低的新的表达系统是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服上述
技术介绍
的不足，提供一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法和应用，本专利技术的基因工程菌能够高效表达具有天然活性的草酸氧化酶，适用于研发重组草酸氧化酶药物、生产低草酸食品及饮料。本专利技术提供一种草酸氧化酶的优化基因，其编码的草酸氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在上述技术方案的基础上，该草酸氧化酶的优化基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供一种重组表达载体，其包含有草酸氧化酶的优化基因。本专利技术提供一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌，包括宿主细胞，所述宿主细胞中含有重组表达载体。在上述技术方案的基础上，所述宿主细胞为里氏木霉。本专利技术还提供上述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：S1、将来源于虫拟蜡菌的草酸氧化酶基因按照里氏木霉的密码子偏好性进行优化，得到草酸氧化酶的优化基因；S2、构建里氏木霉pyr4基因缺失突变株；S3、敲除所述里氏木霉pyr4基因缺失突变株的mus53基因，得到里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株；S4、采用所述草酸氧化酶的优化基因构建重组表达载体；S5、采用所述重组表达载体转化所述里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株，得到重组表达草酸氧化酶的基因工程菌。在上述技术方案的基础上，步骤S2的具体过程如下：S201、提取里氏木霉基因组DNA；S202、采用所述里氏木霉基因组DNA，构建里氏木霉表达质粒载体pMDT05；S203、采用所述里氏木霉基因组DNA构建里氏木霉pyr4基因敲除盒，将所述载体pMDT05与所述里氏木霉pyr4基因敲除盒进行连接，得到里氏木霉pyr4基因敲除载体pMDT05-pyr4KO；S204、将所述载体pMDT05-pyr4KO通过根癌农杆菌介导转化里氏木霉，得到里氏木霉pyr4基因缺失突变株；步骤S3的具体过程如下：S301、采用所述里氏木霉基因组DNA构建里氏木霉mus53基因敲除载体pMDT05-mus53KO；S302、采用所述载体pMDT05-mus53KO通过根癌农杆菌介导法转化所述里氏木霉pyr4基因缺失突变株，得到里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株。本专利技术还提供上述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌在制备草酸氧化酶中的应用，采用所述重组表达草酸氧化酶的基因工程菌制备草酸氧化酶的过程包括以下步骤：将所述重组表达草酸氧化酶的基因工程菌进行培养发酵，得到发酵液，从发酵液中提取草酸氧化酶。本专利技术还提供一种草酸氧化酶，用于降解草酸或草酸盐，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供一种药物组合物，用于预防或治疗草酸过多的疾病，其包含有上述的草酸氧化酶。与现有技术相比，本专利技术的优点如下：(1)本专利技术将经密码子优化、人工合成的草酸氧化酶基因转化入里氏木霉(Trichodermareesei)中，构建能高效表达草酸氧化酶的里氏木霉基因工程菌。本专利技术的里氏木霉基因工程菌摇瓶发酵168h，发酵液上清草酸氧化酶活力可达到6000U/L。该菌株能够分泌表达具有天然活性的草酸氧化酶，为研发一种适用于预防或治疗草酸过多疾病的重组草酸氧化酶药物提供了可能性。(2)里氏木霉是美国食品药品监督管理局(FDA)认证的安全的微生物(GRAS微生物)，适合应用于食品和医疗领域中，是理想的宿主细胞。采用本专利技术的里氏木霉基因工程菌制备的草酸氧化酶能够广泛用于研发生产降草酸药物、加工低草酸食品及饮料。附图说明图1为本专利技术实施例2中的载体pMDT05的构建图谱；图2为本专利技术实施例2中的里氏木霉Rut-C30菌株pyr4基因敲除载体pMDT05-pyr4KO的构建图谱；图3为本专利技术实施例3中的里氏木霉mus53基因敲除载体pMDT05-mus53KO的构建图谱；图4为本专利技术实施例4中的中间表达载体pMDT05-26-8-2-01的构建图谱；图5为本专利技术实施例4中的重组表达载体pMDT05-26-8-2-TrOxO的构建图谱；图6为本专利技术实施例5中的显色法检测草酸氧化酶活性的实验结果。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述。以下实施例是为了更好地说明阐述本
技术实现思路
，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，本专利技术的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。在本说明书中，除非特别指明，否则所用技术术语为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料、试剂如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。本专利技术实施例中用到的里氏木霉Rut-C30(货号ATCC56765)购买自广东微生物菌种保藏中心。实施例1：人工设计并合成草酸氧化酶的优化基因本实施例提供一种草酸氧化酶的优化基因，该基因用于编码一种草酸氧化酶，该草酸氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。其中，该草酸氧化酶的信号肽序列为SEQIDNO.1所示的1～17位氨基酸序列，来源于里氏木霉Rut-C30菌株；该草酸氧化酶的成熟肽序列为SEQIDNO.1所示的18～458位氨基酸序列，来源于虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)。进一步的，本实施例提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种草酸氧化酶的优化基因，其特征在于：其编码的草酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种草酸氧化酶的优化基因，其特征在于：其编码的草酸氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的草酸氧化酶的优化基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组表达载体，其特征在于：其包含有如权利要求1或2所述的草酸氧化酶的优化基因。4.一种重组表达草酸氧化酶的基因工程菌，包括宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞中含有如权利要求3所述的重组表达载体。5.如权利要求4所述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌，其特征在于：所述宿主细胞为里氏木霉。6.如权利要求5所述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将来源于虫拟蜡菌的草酸氧化酶基因按照里氏木霉的密码子偏好性进行优化，得到草酸氧化酶的优化基因；S2、构建里氏木霉pyr4基因缺失突变株；S3、敲除所述里氏木霉pyr4基因缺失突变株的mus53基因，得到里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株；S4、采用所述草酸氧化酶的优化基因构建重组表达载体；S5、采用所述重组表达载体转化所述里氏木霉pyr4基因和mus53基因同时缺失的突变株，得到重组表达草酸氧化酶的基因工程菌。7.如权利要求6所述的重组表达草酸氧化酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤S2的具体过程如下：S201、提取里氏木霉基...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪卫，汪小锋，刘艳红，黄荷，
申请(专利权)人：武汉康复得生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42