尾叶桉F5H基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种尾叶桉F5H基因及其应用，其尾叶桉F5H基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可将该基因应用于转基因植株中，且证明了该基因具有调控S木质素合成的作用。通过对尾叶桉F5H基因功能的研究，有助于推动尾叶桉转基因定向调控木质素合成的基因工程育种。

F5H gene and its application in Eucalyptus urophylla

The invention discloses a gene of Eucalyptus urophylla F5H and its application. The nucleotide sequence of Eucalyptus urophylla F5H gene, such as SEQ ID NO.1, can be applied to transgenic plants, and it is proved that the gene has the role of regulating the synthesis of S lignin. The study on the function of F5H gene in Eucalyptus urophylla is helpful to promote the gene engineering breeding of directional regulation of lignin synthesis by transgenic Eucalyptus urophylla.

【技术实现步骤摘要】
尾叶桉F5H基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及涉及尾叶桉F5H基因及其应用。
技术介绍
桉树是桃金娘科桉属植物的总称，原产地为澳大利亚。广西的桉树研究在我国处于领先地位，20世纪70年代初期就开始引种，经过多年的引种试验及杂交选育，得到了多个优良树种、优良种源及优良家系。桉树生长快、材质好，广西全区桉树面积居全国首位，已经成为短周期原料林的主要造林树种。尾叶桉GLU4无性系(EucalyptusurophyllacloneGLU4)是广西广泛种植的桉树良种，因其纤维素含量、纤维素长度等制浆指标显著优于其他桉树品种，成为纸浆材造林首选树种。从纸浆材生产需求出发，希望木材中的木质素含量更低或更易于去除。然而木质素在维持植物正常生长发育、防御病原菌侵害方面仍具有不可或缺的重要意义，木质素降幅过大对植物具有潜在的不利影响，所以定向调控木质素单体合成，提高其S/G比值，成为纸浆材品质提升的主要研究策略。F5H(阿魏酸-5-羟化酶，ferulate-5hydroxylase,又称CAld5H，松柏醛-5-羟化酶，coniferaldehyde-5-hydroxylase)是植物木质素单体合成中的关键酶之一，F5H基因发现较晚，但其对S木质素合成的限速功能和显著的调控效果，使其立即成为关注的目标。拟南芥F5H突变体中木质素中几乎全部由G木质素组成，在突变体中表达F5H后，S木质素含量提高至95％以上，G木质素含量则极少(Meyer等1998；Weng等2010)。在杨树和烟草中过表达拟南芥F5H基因，转基因植株表现出S木质素的升高(Franke等2000；Stewart等2009)。师竹娟等(2007)用C4H启动子驱动甘蓝型油菜(Brassicanapus)F5H基因的反义片段转化烟草，转化植株花期之前与野生型基本无异，但开花后长势变弱，茎干纤细，茎部Maüle显色程度稍弱于野生型，暗示其S木质素含量可能降低，F5H基因的抑制使木质素沉积发生了改变。F5H的研究结果一致表明上调F5H可以显著提高S木质素含量，但在尾叶桉中尚未有F5H基因分离鉴定出来，利用其中的基因序列进行基因工程调控更是无法开展。本专利技术公开的尾叶桉F5H序列及其在基因工程中的应用，有助于深入尾叶桉F5H基因功能的研究，并推动尾叶桉转基因定向调控木质素合成的基因工程育种。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种尾叶桉F5H基因及其植物表达载体、宿主细胞以及在植物木质素单体合成调控中的应用，以有效地定向提高植物S木质素单体合成，在木质素单体合成调控的基因工程中的发挥重要作用。本专利技术可通过如下技术方案实现：一种尾叶桉F5H基因，其cDNA序列具有如下特征：具有SEQIDNO.1所示的DNA序列；或者其编码具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。本专利技术还提供一种植物表达载体，其包上述的尾叶桉F5H基因或其片段。作为技术方案的优选，所述植物表达载体为pCAMBIA3301。作为技术方案的另一种优选，所述植物表达载体为重组载体pCAMBIA3301-EuF5H。本专利技术还提供一种宿主细胞，其包含如上所述的尾叶桉F5H基因或其片段或者植物表达载体。作为技术方案的优选，所述宿主细胞选自大肠杆菌、农杆菌或植物细胞，如大肠杆菌JM109菌株、农杆菌LBA4404菌株。本专利技术的尾叶桉F5H基因在调控植物木质素单体合成方面的应用，可将尾叶桉F5H基因或其片段转化入植物，也可将所述植物表达载体转化入植物，也可用所述宿主细胞侵染植物，详细的步骤可参考具体实施方式。本专利技术的有益效果：1、本专利技术首次发现了尾叶桉中的参与木质素单体合成的重要基因F5H，并对该基因在木质素单体合成调控中的基因工程应用进行研究。2、本专利技术在烟草中转化表达尾叶桉F5H得到的转基因烟草植株证明了尾叶桉F5H具有促进S木质素单体合成，并对G木质素单体合成具有轻微的抑制的作用，可达到定向调控木质素单体合成的效果。3、本专利技术公开的尾叶桉F5H基因序列及其在基因工程中的应用，有助于深入尾叶桉F5H基因功能的研究，并推动尾叶桉转基因定向调控木质素合成的基因工程育种。4、本专利技术对尾叶桉F5H基因感染烟草植株的木质素单体含量检测：显示转基因烟草植株中G木质素含量比野生型烟草低，S木质素提高30％以上，S/G比值提高30％以上，验证了基因EuF5H对木质素单体含量起到调控作用。附图说明图1：野生型烟草木质部染色图。图2：转基因型烟草木质部染色图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1：尾叶桉F5H基因的cDNA序列克隆在NCBI检索其他植物中已报道的F5H基因序列，blast分析基因保守区，用VectorNTI软件设计得到目标基因特异引物F5H-F/F5H-R，序列如下：F5H-F：GCTAATCCATGGATATTTTCT；F5H-R：CCATTTGCTTGCTCAATATAGA。取移栽培养3～4周的尾叶桉GLU4无性系组培苗茎部组织，采用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TAKARA)提取总RNA，并用RNALAPCR反转录试剂盒(TAKARA)合成cDNA，以上均按试剂盒说明书操作，DNA样品于-80℃保存。以cDNA作为模板，用目标基因特异引物F5H-F/F5H-R采用Ex-Taq聚合酶(TAKARA)扩增基因cDNA片段。PCR扩增产物分别经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后，用普通DNA产物纯化试剂盒(天根)纯化回收，与克隆载体pMD18-T载体16℃连接过夜后转化大肠杆菌JM109，利用抗生素进行平板筛选。随机挑取抗性克隆用目标基因特异引物F5H-F/F5H-R进行PCR验证后，取PCR验证阳性克隆提取质粒并用载体上的通用引物测序，获得具有完整编码区的F5H基因cDNA序列(SEQIDNO.1)，利用NCBI的ORFFinder对F5H基因编码区进行翻译，获得其编码蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNO.2。重组质粒分别命名为pF5H。实施例2、尾叶桉F5H基因正义表达载体构建通过使用工具酶进行双酶切、目的片段回收和连接，将F5H克隆至植物表达载体，如pCAMBIA1301，使得该基因位于启动子如CaMV35S启动子的控制下。按照以下操作方法实施，详细的步骤可根据本领域技术人员已知的方法进行修改：根据尾叶桉F5H基因序列设计引物F5H-F1/F5H-R1，其中上游引物F5H-F1附加了BglII酶切位点，下游引物F5H-R1附加了BstEII酶切位点。F5H-F1：gggagatctgctaatccatggatattttctF5H-R1：gggggtgaccccatttgcttgctcaatataga使用离心柱型普通质粒小提试剂盒(天根)从上述转化的大肠杆菌中提取含有F5H的重组质粒pF5H，以pF5Hr为模板，F5H-F1/F5H-R1为引物，用Ex-Taq酶(TAKARA)对F5H基因进行PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种尾叶桉F5H基因，其特征在于，其cDNA序列具有如下特征：具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或者其编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种尾叶桉F5H基因，其特征在于，其cDNA序列具有如下特征：具有SEQIDNO.1所示的DNA序列；或者其编码具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的多肽。2.一种植物表达载体，其特征在于：包含如权利要求1所述的尾叶桉F5H基因或其片段。3.根据权利要求2所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA3301。4.根据权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为重组载体pCAMBIA3301-EuF5H。5.一种宿主细胞，其特征在于：包含如权利要求1所述的尾叶桉F...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈博雯，刘海龙，肖玉菲，覃子海，张烨，张晓宁，
申请(专利权)人：广西壮族自治区林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：广西,45