一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡技术

本发明专利技术公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡。本发明专利技术采用荧光微球代替胶体金作为标记探针，制备了免疫荧光侧流层析试纸条，灵敏度较胶体金试纸条技术提升10倍以上。本发明专利技术提供的检测技术，既具备ELISA技术的高灵敏度优势，又具备胶体金试纸条技术的现场检测优势，利用便携式荧光免疫分析仪15min就能定量的检测出抗体滴度，现场进行不需要专业的培训和技能，测试操作方便，快速提供结果。本发明专利技术能切实解决目前猪繁殖与呼吸综合征疫情的检测及防控需求。

【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。该病于1987年最早发现于美国。1991年荷兰人Wensvoot等首次从发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒，当时称为Lelystad病毒。随后德国、美国、英国等国家和地区也分离到了该病毒。目前，该病已遍及北美洲及欧洲，在全球范围内传播。郭宝清等(1996)首次从国内疑似PRRS感染猪群中分离出PRRSV，从而证实了本病在我国的存在。随后，在2006年我国爆发高致病性PRRS，所有年龄段的猪均易感染，表现为高烧(41℃)，患病率高达(50-100％)和高死亡率高达(20-100％)。该病传播速度快，导致大量猪被扑杀，给养猪业造成巨大的经济损失。因此，我们迫切需要一种高敏感性、特异性，并且可实现现场快速筛查的检测技术，用于防控疫情发生和疫苗接种后的免疫评价。猪繁殖与呼吸综合征病毒是单股正链RNA病毒，长达15kb，包含有5‘端帽状结构和3′poly(A)尾，含9个大部分首尾连接和重叠的半开放阅读框，简称ORFs(ORFs：ORF1a/1b，ORF2a/2b，andORF3-7)，至少编码14个非结构蛋白和8个结构蛋白(Gp2/E，Gp3，Gp4，Gp5/5a，M，andN)。根据病毒的抗原性，基因组及致病性的差异，PRRSV可分为2个型，即欧洲型(LV株为代表株)和美洲型(ATCC-VR2332株为代表株)，两种毒株间氨基酸的同源性为78％～81％。在我国分离的PRRSV主要是北美型。实验室检测PRRSV抗体技术有很多，包括中和试验，免疫过氧化酶单层试验(IPMAs)，免疫荧光检测(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。然而这些技术需要专业实验室，精密仪器，训练有素的专业技术人员，而且耗时较长，无法用于现场快速检测，不能满足现场筛查的需求。免疫层析技术开始于1980年代，可以准确、快速检测生物标记物如抗原、抗体、蛋白质。目前以胶体金颗粒作为标记标签，制备的胶体金试纸条已经被广泛应用于各个领域，该技术具有检测快捷，可实现现场快速检测的目的。但是由于灵敏度偏低，而且该技术不能像ELISA技术那样对待检样品进行定量，限制了其应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法及其专用检测卡。本专利技术一种检测卡，包括底板、样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫；沿待测液体样本流动方向，样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；标记垫上包被有荧光微球标记的一抗；检测垫上设置有检测线和质控线，检测线上包被有抗原蛋白A和抗原蛋白B，质控线上包被有二抗；所述一抗为抗猪IgG抗体；所述二抗为抗所述一抗的抗体；所述抗原蛋白A为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；(a2)序列表中序列2自N端第35-293位所示的蛋白质；(a3)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；(a4)将(a1)或(a2)或(a3)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。所述抗原蛋白B为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)序列表中序列4所示的蛋白质；(b2)序列表中序列4自N端第35-156位所示的蛋白质；(b3)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；(b4)将(b1)或(b2)或(b3)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。本专利技术还保护一种制备检测卡的方法，包括如下步骤：分别制备抗原蛋白A和抗原蛋白B；沿待测液体样本流动方向，将样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；标记垫上包被有荧光微球标记的一抗；检测垫上设置有检测线和质控线，检测线上包被有抗原蛋白A和抗原蛋白B，质控线上包被有二抗；所述一抗为抗猪IgG抗体；所述二抗为抗所述一抗的抗体；所述抗原蛋白A的制备方法包括如下步骤：将抗原蛋白A的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达得到所述抗原蛋白A；所述抗原蛋白A的编码基因为如下(c1)-(c4)中任一所述的DNA分子：(c1)序列表中序列1所示的DNA分子；(c2)序列表中序列1自5’端第97-876位核苷酸所示的DNA分子；(c3)在严格条件下与(c1)或(c2)限定的DNA序列杂交且编码抗原蛋白A的DNA分子；(c4)与(c1)或(c2)或(c3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码抗原蛋白A的DNA分子；所述抗原蛋白B的制备方法包括如下步骤：将抗原蛋白B的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达得到所述抗原蛋白B；所述抗原蛋白B的编码基因为如下(d1)-(d4)中任一所述的DNA分子：(d1)序列表中序列3所示的DNA分子；(d2)序列表中序列3自5’端第97-465位核苷酸所示的DNA分子；(d3)在严格条件下与(d1)或(d2)限定的DNA序列杂交且编码抗原蛋白B的DNA分子；(d3)与(d1)或(d2)或(d3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码抗原蛋白B的DNA分子。所述抗原蛋白A的编码基因可以通过重组表达载体导入宿主菌。所述重组表达载体可为采用序列表的序列1自5’端第97-876位核苷酸所示的双链DNA分子替代pET-28a(+)载体多克隆位点(例如BamHI和HindIII酶切位点)之间的片段得到的重组表达载体。所述抗原蛋白B的编码基因可以通过重组表达载体导入宿主菌。所述重组表达载体可为采用序列表的序列3自5’端第97-465位核苷酸所示的双链DNA分子替代pET-28a(+)载体多克隆位点(例如BamHI和HindIII酶切位点)之间的片段得到的重组表达载体。以上任一所述宿主菌具体可为Rosetta(DE3)感受态细胞。所述检测垫上，每厘米检测线上附着有1μg所述抗原蛋白A和2μg所述抗原蛋白B。所述检测线的印记方法具体为：将抗原蛋白A和抗原蛋白B按照蛋白含量1∶2的比例混合后，得到混合蛋白溶液，将混合蛋白溶液的浓度调至1.5mg/mL后印迹于检测垫(设置包被量为2μL/cm)。以上任一所述检测垫上，每厘米质控线上附着有4μg所述二抗。所述质控线的印记方法具体为：将二抗溶液浓度调整至2mg/mL后印迹于检测垫(设置包被量为2μL/cm)。以上任一所述一抗为羊抗猪IgG抗体。以上任一所述二抗为兔抗羊IgG。以上任一所述检测垫的材质具体可为玻璃纤维膜。以上任一所述检测垫上，所述检测线与质控线相距0.5cm。以上任一所述检测垫上，所述检测线距检测垫左边的距离为1.0cm。以上任一所述检测垫上，所述质控线距检测垫右边的距离为1.0c本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测卡，包括底板、样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫；沿待测液体样本流动方向，样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；标记垫上包被有荧光微球标记的一抗；检测垫上设置有检测线和质控线，检测线上包被有抗原蛋白A和抗原蛋白B，质控线上包被有二抗；所述一抗为抗猪IgG抗体；所述二抗为抗所述一抗的抗体；所述抗原蛋白A为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；(a2)序列表中序列2自N端第35‑293位所示的蛋白质；(a3)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；(a4)将(a1)或(a2)或(a3)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。所述抗原蛋白B为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)序列表中序列4所示的蛋白质；(b2)序列表中序列4自N端第35‑156位所示的蛋白质；(b3)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；(b4)将(b1)或(b2)或(b3)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。...

【技术特征摘要】
1.一种检测卡，包括底板、样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫；沿待测液体样本流动方向，样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；标记垫上包被有荧光微球标记的一抗；检测垫上设置有检测线和质控线，检测线上包被有抗原蛋白A和抗原蛋白B，质控线上包被有二抗；所述一抗为抗猪IgG抗体；所述二抗为抗所述一抗的抗体；所述抗原蛋白A为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：(a1)序列表中序列2所示的蛋白质；(a2)序列表中序列2自N端第35-293位所示的蛋白质；(a3)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；(a4)将(a1)或(a2)或(a3)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。所述抗原蛋白B为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)序列表中序列4所示的蛋白质；(b2)序列表中序列4自N端第35-156位所示的蛋白质；(b3)在序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；(b4)将(b1)或(b2)或(b3)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。2.一种制备检测卡的方法，包括如下步骤：分别制备抗原蛋白A和抗原蛋白B；沿待测液体样本流动方向，将样品垫、标记垫、检测垫和吸水垫依次固定于底板上；标记垫上包被有荧光微球标记的一抗；检测垫上设置有检测线和质控线，检测线上包被有抗原蛋白A和抗原蛋白B，质控线上包被有二抗；所述一抗为抗猪IgG抗体；所述二抗为抗所述一抗的抗体；所述抗原蛋白A的制备方法包括如下步骤：将抗原蛋白A的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达得到所述抗原蛋白A；所述抗原蛋白A的编码基因为如下(c1)-(c4)中任一所述的DNA分子：(c1)序列表中序列1所示的DNA分子；(c2)序列表中序列1自5’端第97-876位核苷酸所示的DNA分子；(c3)在严格条件下与(c1)或(c2)限定的DNA序列杂交且编码抗原蛋白A的DNA分子；(c4)与(c1)或(c2)或(c3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码抗原蛋白A的DNA分子；所述抗原蛋白B的制备方法包括如下步骤：将抗原蛋白B的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；培养所述重组菌，表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨利敏，刘文军，魏艳秋，孙蕾，李晶，范文辉，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11