DNA液晶生物传感器及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA液晶生物传感器包括捕获探针和隔离探针混合固定于表面镀有一层纳米级厚度金膜的玻片上而制成的工作片基，所述捕获探针由含有m个腺嘌呤A和与待检测物特异性识别结合的一段碱基序列P组成，并标记为AmP1；所述隔离探针含有n个腺嘌呤A的多聚腺嘌呤，并标记为An，所述m为正整数，所述n为自然数。同时公开了该DNA液晶生物传感器的制备方法和检测方法。本发明专利技术一种DNA液晶生物传感器及其制备方法和检测方法，得到的DNA液晶生物传感器除具有液晶传感器相同的优点，探针无需任何化学修饰，高效识别被测物，简化制备步骤；降低制作成本；本发明专利技术还可应用于基于核酸杂交以及核酸适配体分子识别机理为基础的生物分子检测。

【技术实现步骤摘要】
DNA液晶生物传感器及其制备方法和检测方法
本专利技术属于生物传感器
，具体的说，涉及一种DNA液晶生物传感器及其制备方法和检测方法。
技术介绍
脱氧核糖核酸(DNA)，一种内含遗传信息的生物大分子，控制着生物发育及生命机能运作，能直接影响人类遗传和健康。因此，DNA的检测在许多领域如：临床诊断、医药研究、农业生产、食品安全、环境监护等中扮演着极其重要的角色。传统DNA检测技术有：PCR、化学发光分析、电泳相关技术等。然而这些技术操作繁琐、步骤繁多，且必须有昂贵专业仪器设备或专业人员的配置，难以进行远离实验室的原位、实时检测。DNA生物传感器是近年来新发展出的一种分析检测技术，其基本原理源于DNA分子碱基间的互补配对，并将这一杂交信息转变为光、电、声等易于检测信号。与传统的检测技术相比，DNA生物传感检测方法具有快速、灵敏、操作简便等优点。目前普遍采用的DNA生物传感器主要包括以下几种类型：电化学型、荧光型、压电晶体型等。压电晶体型DNA生物传感器由于其自身的结构特点，存在着不易微型化、阵列化，检测下限偏高等问题；电化学的DNA生物传感器具有高灵敏度及成熟的电极理论，但该类传感器也存在难于阵列化的缺点，不适于开发下一代高通量DNA传感器；荧光DNA生物传感器具有高灵敏、易微型化、易阵列化等优点，但存在DNA探针需要荧光标记，荧光标记不但提高了传感器的制造成本，还会影响DNA杂交效率存在着荧光猝灭、光致漂白等问题。另外，荧光DNA生物传感器需昂贵的荧光读取装置。液晶传感器由于具有无需标记，灵敏度高，构造简单，易于微型化与阵列化。无需复杂读取装置肉眼可直接观察光学信号变化等优势。近年来，引发了科学家的广泛关注。DNA生物传感器的构建中，DNA捕获探针固定方法的选取会直接影响传感器的检测性能、制作成本等。目前研究报道的DNA液晶生物传感器中，为将DNA探针固定于传感器基底，需要分别对DNA探针和基底进行一定的化学基团修饰(如在DNA探针末端修饰上巯基、氨基、亲和素等，在基底上修饰APTES、TEA等)，通过DNA探针上修饰基团与基底上修饰基团的反应，实现DNA探针的固定。上述针对DNA的基团修饰不仅提高了传感器制作成本，DNA探针的杂交效率还会受到其上修饰基团的影响。同时，这类固定方式步骤繁多，会影响传感器的可重复性。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种DNA液晶生物传感器及其制备方法和检测方法，得到的DNA液晶生物传感器除具有液晶传感器相同的优点外，还具有以下优点：专利技术中捕获探针无需采用任何化学修饰，既能保证捕获探针高效识别被测物，又可以简化传感器制备步骤；另外，捕获探针既充当液晶的取向分子又作为待测物的识别分子，进一步简化了传感器制作成本和制备步骤；本专利技术还可应用于基于核酸杂交以及核酸适配体分子识别机理为基础的生物分子检测。本专利技术目的是这样实现的：一种DNA液晶生物传感器，其关键在于：包括捕获探针和隔离探针混合固定于表面镀有一层纳米级厚度金膜的玻片上而制成的工作片基，所述捕获探针由含有m个腺嘌呤A和与待检测物特异性识别结合的一段碱基序列P组成，并标记为AmP1；所述隔离探针含有n个腺嘌呤A的多聚腺嘌呤，并标记为An，所述m为正整数，所述n为自然数。捕获探针和隔离探针在使用前均不作任何修饰处理。能与捕获探针发生适配体-配体反应的生物分子，如凝血酶、ATP、肿瘤标志物等。优选地，上述捕获探针和隔离探针的总浓度x为3μmol/L。优选地，上述捕获探针与隔离探针的浓度比y为1：(0～5)。优选地，上述捕获探针与隔离探针的浓度比y为7:5。优选地，上述m为15，n为15，所述碱基序列P的碱基数量为10～30个。优选地，上述金膜包括3nm的铬粘附层和10nm金膜层。一种DNA液晶生物传感器的制备方法，包括工作片基的制备、取向片基的制备，其关键在于所述工作片基的制备为：a、玻片镀金处理：在清洗后的玻片表面镀上一层厚度均匀的金膜得到镀金基底；b、配制DNA探针固定液并制成工作片基：将捕获探针AmP1和隔离探针An溶于缓冲液中并混合制成DNA探针固定液，然后利用聚腺嘌呤Am和An与金膜间较强的特异性吸附能力，将DNA探针固定液固定于所述镀金基底上，制成工作片基；所述捕获探针AmP1的面密度通过所述DNA探针固定液的浓度、捕获探针与隔离探针的浓度比、m和n的值所述捕获探针AmP1的面密度。其中缓冲液为：1mol/L的CaCl2-TE，pH＝7。优选地，上述取向片基的制备为：将另一玻片清洗后并浸泡于液晶取向剂溶液中孵育，反应后经超纯水冲洗后吹干，再于烘箱中高温烘烤交联反应，经表面硅烷偶联处理后的液晶分子垂直取向，制成取向片基。所述液晶取向剂优选DMOAP、OTS等硅烷偶联剂。进一步地，上述步骤a中玻片的清洗过程为①将玻片浸泡在80℃的按体积比为70％H2SO4：30％H2O2制成的水虎鱼溶液中约1h；②取出玻片，并用超纯水冲洗至少5遍；③在乙醇中超声10min；④重复步骤②，然后在甲醇中超声10min；⑤重复步骤②，然后将玻片置于氮气气氛中干燥待用。进一步地，上述镀金基底的清洗过程为①用超纯水将镀金基底冲洗5遍；②在乙醇中超声10min；③超纯水冲洗5遍，然后氮气吹干；④镀金基底置于紫外清洗机中照射25min；⑤依次重复步骤①②③④，2次；⑥重复①②③，待用。一种DNA液晶生物传感器的检测方法，其关键在于：采用滴涂法将一定量的待测液滴加在所述工作片基表面，捕获探针与待测液中的目标检测物在室温下进行孵育反应，2h后用缓冲液、超纯水顺序冲洗，氮气吹干，再在所述取向片基上放置一铜载网，注入液晶，然后盖上经分子识别反应后的工作片基，最后，将取向片基和工作片基夹具固定，组成三明治结构的液晶盒，将所述液晶盒于偏光显微镜下观察并采集图像，通过图像的明暗程度及验收实现对待测的的半定量检测。优选地，上述液晶为向列相液晶，包括5CB或E7。有益效果：本专利技术是一种DNA液晶生物传感器及其制备方法和检测方法，采用新颖的DNA探针固定方法，即通过DNA探针末端聚腺嘌呤与金膜间较强的特异性吸附将探针固定于镀金玻片表面，免于对DNA探针功能化修饰，既简化了传感器的制作步骤，又避免了修饰基团的引入影响固定化捕获探针与目标检测物之间的分子识别。另外，本专利技术构建的液晶生物传感器中，捕获探针既充当液晶分子的取向分子又作为目标检测物的识别分子，使得该传感器制作简便、成本较低，且具有良好的选择性和灵敏度。还有，选取特定适配体DNA序列作为DNA捕获探针，利用适配体-配体反应，还可以实现其他有机小分子、RNA、蛋白质等的检测。附图说明图1为液晶盒结构示意图；图2为捕获探针与隔离探针的浓度比y对DNA液晶生物传感器的影响；图中：a、DNA探针固定液中捕获探针AmP1与隔离探针摩尔数比值y＝1：0，b、y＝2：1，c、y＝7：5，d、y＝1：1，e、y＝5：7，f、y＝1：2；图3为DNA液晶生物传感器检测不同浓度的目标DNA序列的检测结果；图中a为待检测液中目标DNA浓度为0；b为待检测液中目标DNA浓度为100nmol/L；c为待检测液中目标DNA浓度为1nmol/L；d为待检测液中目标DNA浓度为10pmol/L；e为待检测液中目本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA液晶生物传感器，其特征在于：包括捕获探针和隔离探针混合固定于表面镀有一层纳米级厚度金膜的玻片上而制成的工作片基，所述捕获探针由含有m个腺嘌呤A和与待检测物特异性识别结合的一段碱基序列P组成，并标记为AmP1；所述隔离探针含有n个腺嘌呤A的多聚腺嘌呤，并标记为An，所述m为正整数，所述n为自然数。

【技术特征摘要】
1.一种DNA液晶生物传感器，其特征在于：包括捕获探针和隔离探针混合固定于表面镀有一层纳米级厚度金膜的玻片上而制成的工作片基，所述捕获探针由含有m个腺嘌呤A和与待检测物特异性识别结合的一段碱基序列P组成，并标记为AmP1；所述隔离探针含有n个腺嘌呤A的多聚腺嘌呤，并标记为An，所述m为正整数，所述n为自然数。2.根据权利要求1所述的DNA液晶生物传感器，其特征在于：所述捕获探针和隔离探针的总浓度x为3μmol/L。3.根据权利要求1或2所述的DNA液晶生物传感器及其制备方法和检测方法，其特征在于：所述捕获探针与隔离探针的浓度比y为1：(0～5)。4.根据权利要求3所述的DNA液晶生物传感器及其制备方法和检测方法，其特征在于：所述捕获探针与隔离探针的浓度比y为7:5。5.根据权利要求1所述的DNA液晶生物传感器及其制备方法和检测方法，其特征在于：所述m为15，n为15，所述碱基序列P的碱基数量为10～30个。6.根据权利要求1所述的DNA液晶生物传感器的制备方法，其特征在于：所述金膜包括3nm的铬粘附层和10nm金膜层。7.一种权利要求1～6任一项所述的DNA液晶生物传感器的制备方法，包括工作片基的制备、取向片基的制备，其特征在于所述工作片基的制备为：a、玻片镀金处理：在清洗后的玻片表面镀上一层厚度均匀的...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊兴良，刘慧龙，陈龙聪，江奇锋，梁波，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50