一种微体积细胞核酸扩增方法技术

本发明专利技术提供一种微体积细胞核酸扩增方法，包括：a)包裹少量细胞的微液滴加入到预先加载油相的小型容器中，并离心使其沉降；b)细胞裂解液液滴通过油相液面以下微体积注射加入到小型容器中,并离心使其沉降与细胞液滴融合，实现细胞的裂解和核酸物质的释放；c)裂解中止液液滴通过微体积注射加入，并离心使其与裂解后细胞液滴融合，对裂解反应进行中和或终止；d)一种或一种以上扩增反应液通过微体积注射加入，并离心融合，在适当温度下，对基因组、转录组或特定核酸序列进行扩增。本发明专利技术提供的细胞核酸扩增方法操作简单、成本低、通量高，反应体积可缩小至纳升级别。

A microcell nucleic acid amplification method

The invention provides a microcell nucleic acid amplification method, including: a) the microdroplets wrapped in a small number of cells are added to a small container with pre loaded oil phase and centrifuged to settle down; b) cell lysate drops are injected into a small volume by microinjection of the oil phase level below the liquid level and centrifuge to merge the liquid droplets with the cell droplets. To achieve the lysis of the cells and the release of the nucleic acid substances; c) the lysate drops are injected by microvolume injection, and are centrifuged to fuse with the lysed cell drops and neutralize or terminate the cracking reaction; d) one or more amplification reactions are injected by microvolume and centrifugally fused at a suitable temperature, Amplification of genome, transcriptome or specific nucleic acid sequence. The cell nucleic acid amplification method provided by the invention has simple operation, low cost and high flux, and the reaction volume can be reduced to the nano level.

【技术实现步骤摘要】
一种微体积细胞核酸扩增方法
本专利技术涉及微量液体生化反应和分析领域，具体涉及一种基于纳升微液滴操作的细胞核酸扩增

技术介绍
细胞是地球生命活动的基本单元。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物细胞内。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，而RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用。单细胞的核酸扩增技术是在单细胞水平对全基因组或转录组等核酸分子进行扩增与测序的一项新技术。其原理是以分离的单个细胞的微量DNA或RNA为模板进行扩增，从而获得大量核酸物质用于后续序列和功能的分析(Gawad,C.,W.KohandS.R.Quake,Single-cellgenomesequencing:currentstateofthescience.NatRevGenet,2016.17(3):p.175-188)。单细胞测序能够解析用组织样本测序无法揭示的细胞异质性，为深入理解单细胞行为、机制及其与机体的关系等提供了新的视角。此外，单细胞测序对于未培养微生物功能和基因资源挖掘，临床胚胎植入前筛查，干细胞与细胞分化机制等方面均具有巨大的意义。现有的单细胞核酸扩增技术主要有两种，一种是将分离的单细胞在微升体积水平进行扩增反应(Spits,C.,etal.,Whole-genomemultipledisplacementamplificationfromsinglecells.NatProtoc,2006.1(4):p.1965-1970)。在微升体积水平对单细胞进行全基因组扩增反应，容易出现大量非特异扩增产物(deBourcy,C.F.,etal.,Aquantitativecomparisonofsingle-cellwholegenomeamplificationmethods.PLoSOne,2014.9(8):e105585)，而进行普通PCR扩增会由于模板量太低而导致扩增失败，且利用这种方式会消耗较多试剂，成本较高，通量较低。另一种是利用微流控芯片装置，在微小的流体管路中对单细胞进行裂解扩增等过程(deBourcy,C.F.,etal.,Aquantitativecomparisonofsingle-cellwholegenomeamplificationmethods.PLoSOne,2014.9(8):e105585)。反应体积在几十至几百纳升级别，但是装置比较复杂，需要不同的压力源驱动，且需要受过一定培训的实验人员才能操作，而芯片的加工也较为复杂、成本较高、通量低，不适合普及推广。总之，现有技术操作复杂、成本较高、通量低，不能够得到普及。
技术实现思路
为了解决现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种基于微液滴的细胞核酸扩增方法，本专利技术提供的细胞核酸扩增方法操作简单、成本较低且通量较高，反应体积缩小至纳升级别，成本降低至原先的百分之一以下，能有效降低非特异扩增，提高单细胞模板浓度。本专利技术的一种微体积细胞核酸扩增方法，包括以下步骤：a)准备一个小型容器，里面预先加入油相。优选的，小型容器底部为U型或V型，以保证沉落的液滴可以依靠重力作用，定位至管底部中央位置。容器可以是单个小型容器，如单个离心管，也可以是多个小型容器连在一起，如8联管等，还可以是96孔板、384孔板等多孔板。优选为384孔板，其通量高且与实时荧光PCR仪器匹配，可进行扩增过程的实时监控。容器中预先装载油相，可以是矿物油、液态烷烃、酯类、硅油等与水相互不相溶且比重小于水的液体，优选为矿物油，其生物兼容性好，耐高温、成本低。b)利用任何一种单细胞分离提取技术，将少量细胞以纳升液滴包裹的形式加载到小型容器中，被油相覆盖，放置在a)中所述小型容器的油相中，使之沉于容器底部。细胞可以是动物、植物、微生物等细胞，优选为活细胞并处理细胞悬液状态。细胞数量是单细胞，多个细胞，或细胞团聚体。单细胞分离提取技术可以使用目前采用的方法，包括显微切割、微量吸取、梯度稀释、流式分选、光镊、微流控芯片分选等。优选为流式分选法，该方法通量高，速度快，且与多孔板小型容器匹配。c)以微体积注射的方法，将细胞裂解液通过插入小型容器中油相表面以下的第一微管道加入小型容器中，被油相覆盖，并与细胞液滴融合，在一定温度、时间等条件下裂解细胞，释放核酸物质。微管道可以是特氟龙软管、毛细管、移液器吸头、玻璃管等，优选为特氟龙软管，内径为30-300μm。微体积注射的驱动装置优选为微量注射泵驱动的注射器，能够精确控制加注液体的量与速度。加注液滴精度在1nL-1μL。细胞裂解液根据细胞类型不同，可以采用不同配方，如强酸、强碱、表面活性剂、低渗溶液、含有蛋白酶、溶菌酶等。优选为强碱溶液。使细胞裂解的方法需要根据细胞类型不同，选择不同的温度、时间、方法等条件，可以选用的裂解方式有:物理法、化学法、生物法等。优选为高温裂解法。d)以微体积注射的方法，将裂解中止液通过第二微管道加载到小型容器中，被油相覆盖，并步骤c)的液滴融合，实现细胞裂解步骤的中和或终止；反应中止液或中止方法需要根据步骤c)中采用的细胞裂解方法进行选择和搭配，原则上使细胞裂解过程中止并且不影响后续扩增过程。优选为酸性溶液，使步骤c)中的裂解液得到中和，pH呈中性，避免释放的核酸物质在强碱性溶液中暴露时间过长而被破坏。e)以步骤c)所述的微体积注射的方法，将一种或多种不同的扩增反应液分别通过第三或第四微管道等，分别注入到小型容器中，被油相覆盖，并与前一步骤的液滴融合，在一定温度和时间条件下，实现少量细胞微体积核酸扩增。扩增反应液可以是全基因组扩增反应液，根据不同全基因组扩增方案采用相应试剂，如多重置换扩增(MultipleDisplacementAmplification，MDA)，退化寡核苷酸引物PCR(DegenerateOligonucleotidePrimedPCR，DOC-PCR)，多次退火环状循环扩增(MultipleAnnealingandLooping-BasedAmplificationCycles，MALBAC)等；反应扩增液也可以是普通PCR反应液或其它恒温扩增反应液，如环介导核酸等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，滚环扩增技术(rollingcircleDNAamplification，RCA)等。优选为MDA全基因组扩增，反应液体积可以为200-500nL。反应优选为在实时荧光PCR仪中对扩增反应进行实时荧光监测，扩增反应时间为1-16小时。f)反应产物可以用于后续实验。反应产物为经扩增之后的核酸物质，后续对其进行的实验包括产物的纯化、鉴定、核酸扩增、建库测序等。纯化是对扩增产物中的引物、短片段、酶、缓冲液等进行去除，提高扩增产物纯度。鉴定是对扩增产物进行质量检测，可以进行凝胶电泳，也可以用相关分析仪器对其质量和浓度进行测定。核酸扩增是指以扩增产物为模板，进行第二次核酸扩增，可以是全基因组扩增，也可以是由特异引物引导的靶基因特异扩增。建库测序是对扩增产物进行核酸序列分析，获取核酸信息。附图说明为了更清楚地说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微体积细胞核酸扩增方法，其特征在，包括以下步骤：(a)小型容器中加入油相；(b)将少量细胞以纳升液滴包裹的形式加载到小型容器中，被油相覆盖；(c)以微体积注射方法，将细胞裂解液通过插入小型容器中油相表面以下的第一微管道注入小型容器中，被油相覆盖，并与细胞液滴离心融合，在一定温度和时间条件下，实现少量细胞的裂解；(d)以步骤c中所述的微体积注射方法，将裂解中止液通过第二微管道注入小型容器中，被油相覆盖，并与所述步骤c的液滴离心融合，在一定温度和时间条件下，实现细胞裂解步骤的中和或终止；(e)以步骤c所述的微体积注射方法，将一种或多种不同的扩增反应液分别通过第三或第四微管道，分别注入到小型容器中，被油相覆盖，并与前一步骤的液滴离心融合，在一定温度和时间条件下，实现少量细胞微体积核酸扩增。

【技术特征摘要】
2016.12.27 CN 20161122706211.一种微体积细胞核酸扩增方法，其特征在，包括以下步骤：(a)小型容器中加入油相；(b)将少量细胞以纳升液滴包裹的形式加载到小型容器中，被油相覆盖；(c)以微体积注射方法，将细胞裂解液通过插入小型容器中油相表面以下的第一微管道注入小型容器中，被油相覆盖，并与细胞液滴离心融合，在一定温度和时间条件下，实现少量细胞的裂解；(d)以步骤c中所述的微体积注射方法，将裂解中止液通过第二微管道注入小型容器中，被油相覆盖，并与所述步骤c的液滴离心融合，在一定温度和时间条件下，实现细胞裂解步骤的中和或终止；(e)以步骤c所述的微体积注射方法，将一种或多种不同的扩增反应液分别通过第三或第四微管道，分别注入到小型容器中，被油相覆盖，并与前一步骤的液滴离心融合，在一定温度和时间条件下，实现少量细胞微体积核酸扩增。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微体积注射方法，采用一端开口的微管道，管道内充满被注射液体，通过注射泵从位于油相液面以下的微管道管口推出微量液体，再提升微管道管口脱离油相液面，使推出的微量液体以油包水的形式留在油相中。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液滴融合，在小型容器内借助离心机的离心作用，使液滴沉降并汇集在小型容器的底部并发生融合反应。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微管道是内径为30-300微米的特氟...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜文斌，徐鹏，贠娟莉，戴欣，郑小伟，黄力，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11