本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用。氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第99位的亮氨酸突变为丙氨酸，且第162位的亮氨酸突变为甘氨酸，第230位的谷氨酸突变为甘氨酸。相比于野生型，本发明专利技术的植酸酶突变体的胃蛋白酶抗性明显提高，胃蛋白抗性、耐酸性和热稳定性同时得到改良，在饲料工业上具有巨大的应用潜力。
Phytase mutant modified by pepsin resistance and its coding gene and Application
The invention relates to the field of gene engineering, in particular to a phytase mutant with improved pepsin resistance, and its coding gene and application. The ninety-ninth - bit leucine of the phytase in the amino acid sequence, such as SEQ ID NO.1, mutated to alanine, and the 162nd - bit leucine mutation was glycine, and the 230th - bit glutamic acid was mutated to glycine. Compared with the wild type, the pepsin resistance of the mutants of the present invention is obviously improved, the resistance to the stomach protein, the acid resistance and the thermal stability are improved at the same time, and it has great potential for application in the feed industry.
【技术实现步骤摘要】
胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用。
技术介绍
植酸酶，又叫肌醇六磷酸水解酶，能够水解植酸的磷酸单酯键释放无机磷。单胃动物饲料中添加植酸酶能够可有效地提高植酸磷的利用效率、降低动物养殖区的磷排放对环境的污染。目前自然界获得的大多数植酸酶，其胃蛋白抗性较差，很难满足饲料工业的要求。根据胃蛋白酶的作用特点，利用定点突变技术改良植酸酶的胃蛋白酶抗性，有利于酶学性质改良与新酶资源挖掘，在饲料工业上有潜在应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种胃蛋白酶抗性提高的植酸酶突变体。本专利技术另一目的是提供编码上述胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体的基因。本专利技术的另一目的是提供包含上述胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体基因的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含上述胃蛋白酶抗性改良植酸酶突变体基因的重组菌株。本专利技术的另一目的是提供上述胃蛋白酶抗性改良植酸酶的应用。本专利技术对克氏耶尔森氏菌(Yersiniakristensenii)来源植酸酶YkAPPA基因进行定点突变，该植酸酶YkAPPA的成熟蛋白具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列编码的。SEQIDNO.1MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGLLPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIEVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.SEQIDNO.2Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcacaatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatgatgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatgggcgggttctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgttgaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgatttgaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaattggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcaccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatcgaggtaaataaagaagggacaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgtcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacgctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaattgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa根据本专利技术的胃蛋白酶抗性提高的植酸酶YkAPPA的突变体，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的植酸酶的第99位的亮氨酸突变为丙氨酸，进一步，第162位的亮氨酸突变为甘氨酸，再进一步突变，第230位的谷氨酸突变为甘氨酸。根据本专利技术的具体实施方式，采用定点突变的方法，获得了3个胃蛋白酶抗性提高的的植酸酶突变体，分别命名为YkAPPA-L99A、YkAPPA-L99A/L162G和YkAPPA-L99A/L162G/E230G，即：YkAPPA-L99A为第99位亮氨酸突变为缬氨酸；YkAPPA-L99A/L162G为第99位亮氨酸突变为缬氨酸且第162位亮氨酸突变为甘氨酸；YkAPPA-L99A/L162G/E230G为第99位亮氨酸突变为缬氨酸且第162位亮氨酸突变为甘氨酸且第230位谷氨酸突变为甘氨酸。因此根据本专利技术的具体实施方式的胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体YkAPPA-L99A，其中第99位亮氨基酸突变为丙氨酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示SEQIDNO.3MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGALPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIEVNKEGTK本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第99位的亮氨酸突变为丙氨酸。
【技术特征摘要】
1.胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的植酸酶的第99位的亮氨酸突变为丙氨酸。2.胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的植酸酶的第99位的亮氨酸突变为丙氨酸，且第162位的亮氨酸突变为甘氨酸。3.胃蛋白酶抗性改良的植酸酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的植酸酶的第99位的亮氨酸突变为丙氨酸，且第162位的亮氨酸突变为甘氨酸，第230位的谷氨酸突变为甘氨酸。4.一种植酸酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1、2或3所述的胃蛋白酶抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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