一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法技术

一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于饱和湿度培养箱中培养，在培养液中加入吉西他滨进行诱导，待细胞恢复正常生长时，浓度递增，当细胞能在0.5μmol/L浓度下正常生长、传代时，用1.0μmol/L吉西他滨冲击培养，立即更换吉西他滨浓度为0.5μmol/L的培养基培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在10.0μmol/L的吉西他滨中生长，获得能够在含有10μmol/L吉西他滨的培养体系中稳定生长、传代的人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系。本发明专利技术的方法简便易行、建立时间短；且耐药指数均达10以上。

A method for preparing gemcitabine resistant cell line of human gallbladder cancer

A method of preparation of gemcitabine resistant cell line in human gallbladder carcinoma was prepared. The human gallbladder cancer cells in the logarithmic growth period were inoculated in DMEM culture containing newborn fetal bovine serum, cultured in a saturated humidity incubator, and induced by gemcitabine in the culture medium. When the cells were restored to normal growth, the concentration increased gradually. In the normal growth and passage of 0.5 mu mol/L, the culture medium was cultured with 1 mol/L gemcitabine, and the medium of gemcitabine was replaced by 0.5 u mol/L for 5~10 days. When the cells grew steadily and passed, the cells could grow again until the cells could grow in the 10 u mol/L gistabine, which could be contained in 10 mu mo. L/L gemcitabine culture system stable growth, passage of human gallbladder cancer gemcitabine resistant cell line. The method of the invention is simple and convenient, and the establishment time is short, and the drug resistance index reaches over 10.

【技术实现步骤摘要】
一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种细胞系，具体来说是一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法。
技术介绍
胆囊癌是胆管系统最为常见的恶性肿瘤，近年来其发病率呈上升趋势，致死率一直居高不下，主要原因是胆囊癌患者在早期无特异性症状，因此大部分患者就诊时已属晚期，此外，虽然手术切除是目前的主要治疗手段，但80％的患者在确诊时就已发生转移，手术切除率不到30％，术后复发率很高，预后极差，因此药物化疗对于晚期胆囊癌患者尤为重要。吉西他滨(Gemcitabine，GEM)是一种核苷类抗代谢药物，可以竞争性抑制DNA的合成，导致肿瘤细胞的死亡，广泛用于多种肿瘤的治疗。以吉西他滨为基础联合铂类化疗药已成为晚期胆囊癌的首选治疗方案，但无法避免的是胆囊癌患者会对吉西他滨产生耐药性。目前关于胆囊癌吉西他滨耐药机制的研究主要集中在耐药相关蛋白以及耐药基因的表达，尚缺乏系统性的研究，尤其是其关键基因及中心环节的信号通路的研究，此外，关于逆转胆囊癌耐药的研究也很少，其主要原因是胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的缺乏。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，所述的这种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法要解决现有技术中没有合适的细胞系用于研究胆囊癌吉西他滨耐药机制的技术问题。本专利技术提供了一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，包括如下步骤：取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养，在上述含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入吉西他滨进行诱导，吉西他滨的初始浓度为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以0.1μmol/L浓度递增，当细胞能在含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液下正常生长、传代时，用含吉西他滨浓度为1.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，然后更换含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，然后以1.0μmol/L的浓度递增，当细胞能在含有4.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含有10.0μmol/L的吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击诱导12h，再更换含有吉西他滨浓度为4.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有10.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，获得了能够在含有10μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中稳定生长、传代的人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系。进一步的，所述的人胆囊癌细胞为GBC-SD或者SGC-996细胞。本专利技术以人胆囊癌细胞系GBC-SD、SGC-996为亲本细胞，采用吉西他滨(Gemcitabine，GEM)模拟化疗过程，采用大剂量冲击结合逐步增加剂量法，分别建立获得性胆囊癌耐药细胞系GBC-SD/GEM、SGC-996/GEM，并测定其生物学特性以评价耐药细胞系。本专利技术建立胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法简便易行、建立时间短；且耐药指数均达10以上。本专利技术可用于研究胆囊癌对吉西他滨耐药的分子机制、逆转肿瘤耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物，发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术以人胆囊癌GBC-SD、SGC-996细胞为对象，采用逐步增加药物浓度法建立其吉西他滨耐药细胞株，对胆囊癌耐药机制的研究、指导临床用药以及开发、评价新药等具有重要的应用价值。本专利技术建立所得的两种胆囊癌耐药细胞株可直接用于抗癌药物的敏感性、耐药性机制的研究、筛选和评估新型抗肿瘤药物等。附图说明图1倒置显微镜下GBC-SD(A、C)与GBC-SD/GEM(B、D)的形态。图2倒置显微镜下SGC-996(A、C)与SGC-996/GEM(B、D)的形态。图3GBC-SD与GBC-SD/GEM的生长曲线。图4SGC-996与SGC-996/GEM的生长曲线。图5GBC-SD与GBC-SD/GEM对吉西他滨的耐受性。图6SGC-996与SGC-996/GEM对吉西他滨的耐受性。图7胆囊癌细胞及其耐药细胞的平板克隆图(A)；克隆计数(B)。图8胆囊癌细胞及其耐药细胞的迁移能力(A)；迁移计数(B)。具体实施方式实施例1：耐药细胞系的诱导采用大剂量冲击结合逐步增加剂量法诱导胆囊癌细胞耐药。取对数生长期的人胆囊癌细胞GBC-SD(BNF-2472)与SGC-996(JN-C0997)，(均购自上海榕柏生物技术有限公司)接种在含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，在含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入吉西他滨进行诱导，初始浓度均为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以吉西他滨0.1μmol/L浓度递增，当细胞能在含吉西他滨0.5μmol/L、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含1.0μmol/L吉西他滨、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，立即更换含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在含1.0μmol/L的吉西他滨、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，然后以1.0μmol/L的浓度递增，当细胞能在含吉西他滨4.0μmol/L浓度、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含10.0μmol/L的吉西他滨、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击诱导12h，立即更换吉含西他滨浓度为4.0μmol/L、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次冲击，直至细胞能在含10.0μmol/L的吉西他滨、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，历时四个月，最终获得了能够在含有10μmol/L吉西他滨、含20％新生胎牛血清的DMEM培养液中稳定生长、传代的GBC-SD与SGC-996细胞，依次命名为GBC-SD/GEM与SGC-996/GEM耐药细胞。实施例2：形态学观察利用倒置相差显微镜观察GBC-SD与SGC-996细胞在吉西他滨诱导前后的细胞形态，并拍照记录。如图1所示，GBC-SD细胞大小形态较规则，轮廓清晰，细胞间结构紧密，而GBC-SD/GEM细胞形态不规则，轮廓模糊，多具长伪足，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，其特征在于包括如下步骤：取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养，在上述含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入吉西他滨进行诱导，吉西他滨的初始浓度为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以0.1μmol/L浓度递增，当细胞能在含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液下正常生长、传代时，用含吉西他滨浓度为1.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，然后更换含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，然后以1.0μmol/L的浓度递增，当细胞能在含有4.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中正常生长、传代时，用含有10.0μmol/L的吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击诱导12h，再更换含有吉西他滨浓度为4.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有10.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中生长，获得了能够在含有10μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中稳定生长、传代的人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系。...

【技术特征摘要】
1.一种制备人胆囊癌吉西他滨耐药细胞系的方法，其特征在于包括如下步骤：取对数生长期的人胆囊癌细胞接种在含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、含有CO2体积百分比浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养，在上述含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液中加入吉西他滨进行诱导，吉西他滨的初始浓度为0.2μmol/L，待细胞恢复正常生长时，以0.1μmol/L浓度递增，当细胞能在含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液下正常生长、传代时，用含吉西他滨浓度为1.0μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，然后更换含吉西他滨浓度为0.5μmol/L、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液培养5～10天，待细胞稳定生长、传代时，再次用含1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓度为20％新生胎牛血清的DMEM培养液冲击培养12h，直至细胞能在含有1.0μmol/L吉西他滨、含体积百分比浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：锁涛，刘厚宝，王刚，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，麦递途医疗科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31