稳定杂交的纳米悬浮剂是由抗癌剂和多药调节剂药物一起封装并按一定比例由食物蛋白涂抹的纳米粒包埋。食物蛋白作为一种稳定剂用于稳定杂交纳米悬浮剂。纳米悬浮剂运输这两种药物到肿瘤位点，逆转紫杉醇耐药性肺腺癌细胞系的耐药性以及提高细胞凋亡比例。此外，杂交纳米悬浮剂是根据抗溶剂配制方法而制成，使用丙酮为药物溶剂。这种杂交纳米悬浮剂是稳定的并能释放多耐药性调节药物失活P‑糖蛋白和还原及提高抗癌药物的抗肿瘤效果。这种杂交纳米悬浮剂是稳定的均质的可用于耐药肿瘤的治疗。
A stable hybrid nanoscale suspension for multidrug resistance reversal
Stable hybrid nanoscale suspension is encapsulated by anticancer drugs and multi drug regulator drugs, and is embedded in a certain proportion of nanoparticles coated with food proteins. As a stabilizer, food protein is used to stabilize hybrid nanoscale suspension. Nanoscale carriers transport these two drugs to tumor sites, reversing drug resistance and increasing the proportion of apoptosis in paclitaxel resistant lung adenocarcinoma cell lines. In addition, the hybrid nanoscale suspension is based on the preparation of anti solvent, using acetone as a drug solvent. The hybrid nanoscale suspension is stable and can release multi drug resistant drugs to inactivate P glycoprotein and restore and enhance the anti-tumor effect of anticancer drugs. This hybrid nanoscale suspension is stable and homogeneous and can be used for the treatment of drug-resistant tumors.
【技术实现步骤摘要】
一种用于多抗药性逆转的稳定杂交纳米悬浮剂
：本专利技术属于生物医学领域，尤其是对于常规化疗产生抵抗性实体瘤耐药性领域。制备过程使用含有PTX的DSF和无毒理作用的β-LG通过下调MDR-1基因从而杀伤肿瘤，这种咋加的纳米悬浮颗粒剂型主要可应用于产生耐药性的肿瘤。
技术介绍
：化疗是一种很重要的抗癌疗法，但是单一疗法非常的不理想，这主要是由于治疗中的副作用、极小的吸收量以及不断增长的对于化疗的耐药性。联合化疗可以调控肿瘤细胞的信号通路，到达协同克服单一化疗弊端的作用。然而这种混合治疗也拥有很多的不足，比如联合药物不同的物理化学性质、不同的药代动力特征、多药物不同的体内分布以及不同的细胞膜传递机制，都导致了联合药物不能在靶目标位置达到最佳的释放浓度。多药物耐药性(MDR)的产生是影响癌症治疗的主要屏障。因此，逆转MDR是肿瘤细胞化学成败的核心决定因素。MDR的提高主要是由MDR-1编码的P-糖蛋白过表达引起的。P-糖蛋白，一种膜结合转运体属于ATP-BindingCassette(ABC)家族，允许化疗药物从肿瘤细胞中流出。不溶性活性化合物的纳米悬浮液(Ns)是一种胶体分散体，由纳米颗粒和少量稳定剂组成。对比其他纳米药物，如脂质体、聚合物胶束以及无机纳米运输载体，Ns拥有明显更好的药物载量能力，这主要是因为Ns中粒子含有100％的药物。此外，还可以减少个体差异性和食物效应，改善了治疗效果，降低副作用，降低了对正常器官的毒性。同时，Ns中由β-LG包裹的粒子可以显著提高在血液循环中的半衰期。戒酒硫(DSF)1951年已被FDA证明是一种不溶性的药物，可用于治疗酗酒，同时拥有逆转MDR的潜力。DSF通过与半胱氨酸相互作用抑制P-糖蛋白调节药物外流的能力，从而恢复化疗对癌症细胞的治疗作用。化疗药物PTX阻断了细胞分裂所需微管的动态不稳定性，从而导致细胞凋亡和细胞周期的快速分裂。
技术实现思路
：本专利技术的目的是制备一利稳定的含有不溶于水的紫杉醇和戒酒硫的在肿瘤靶点发挥作用的纳米悬浮剂型。PTX和DSF按照固定的6∶1W/W的比例溶于丙酮以形成双药有机相。β-LG溶于水并在90-100℃下加热30-40分钟形成pH7-9的液相。PTX-DSFNs使用抗溶沉淀法制备，及在低于4-8℃的冰浴中将有机相混入液相。之后PTX-DSFNs立即被超声处理15-30分钟。荧光素5(6)-isothiocyanate(FITC)标记的TX-DSFNs(FITC-PTX-DSFNs)orFITC-PTXNs使用相似的方法制备，除了FITC，DSF和PTX在使用前一同被溶于丙酮。PTX-DSFNs剂型直径在纳米级(160-200nm)并带有负界达电位(-20-30mV)。液体及冷冻形式的PTX-DSFNs以粉末形式经过电镜，透射式电子显微镜，及粉末衍射分析(PXRD)。本专利技术对于MDR调节器和抗癌药物都有很高的载药能力，约为30-40％的PTX和6-8％的DSF。本专利技术可在肿瘤靶点释放DSF用于逆转MDR和提高A549细胞抵抗PTX耐药性的敏感度。本专利技术显著提高了A549/TAX细胞对于PTX的摄取，相比较PTX敏感A549细胞，通过改变核苷酸结合区域内的半胱氨酸残基降低了DSF下调P-糖蛋白的表达，这导致了摄取更高的细胞毒性药物。两种纳米粒，FITC-PTXNs和FITC-PTX-DSFNs，分别于A549/TAX共培养12-24个小时，并用荧光素FITC孵育0.5-12小时，其浓度固定为400-800ng/ml。细胞最初摄取FITC-PTXNs的速度是与时间相关的，随后出现了令人意外的衰减。另一方面，FITC-PTX-DSFNs随着时间的推移显著提高了荧光强度。细胞摄取FITC-PTX-DSFNs差不多是FITC-PTXNs的2倍到14倍。经过共聚焦检测，A549/TAX细胞显示出了细胞外围的绿色荧光，相反的FITC-PTX-DSFNs处理过的细胞，展现出明显的细胞内绿色和黄色荧光型号。本发现结果如下，(i)A549/TAX细胞过度表达P-糖蛋白，因此排斥FITC-PTXNs，从而在细胞外可见绿色荧光。(ii)A549/TAX细胞中FITC-PTX-DSF的DSF成功的于P-糖蛋白相互作用，显著抑制了FITC-PTX-DSF流出，并随着时间的推移逐渐在细胞内聚集。本专利技术展现了24和48小时后的剂量依赖性细胞毒性，总体来说，生存力随着PTX药物浓度从0.1-100μg/ml的提高而降低。与单药物相比较，在A549细胞中，PTX-DSF和PTX-DSFNs提共了更多的毒性。本专利技术与PTX-DSF相比，针对A549/TAX耐药株细胞拥有更好的细胞凋亡诱导能力，这说明其在体外拥有更好的抗MDR相关癌症的能力。IC50是基于计算自由PTX、自由DSF、PTX-DSF和PTX-DSFNs中PTX浓度得到，以确定PTX-DSFNs于PTX-DSF比较的好处，结果展示与Table1。在A549细胞中，与细胞毒素PTX比较，PTX-DSF在24小时培养之后，降低了IC50值大约2.3倍，在48小时培养之后降低了2.6倍。但是，PTX-DSFNs在24小时和48小时培养之后，IC50值大约降低了6倍。换用A549/TAX细胞，同理，使用PTX-DSF和PTX-DSFNs培养24/48小时之后则分别降低了2.2/2.4倍和6/8倍。这证明了，本专利技术可以很好地发挥两个药物的联合作用，提高了大约1.75-5倍的细胞凋亡率，降低了2-7倍的IC50值，以及通过降低MDR-1的表达，而降低了5.8-8.9倍的PTX剂量。本专利技术可诱导A549和A549/TAX细胞凋亡。Annexin-V/FITC结果显示，相比于单药物，PTX-DSF和PTX-DSFNs都可以显著诱导大量细胞凋亡。然而，两种剂型诱导细胞凋亡的总比例却大致相似约77％。与此相反，PTX-DSF联合用药可以显著提高A549/TAX凋亡的比例，PTX-DSFNs诱导凋亡的比例约为80％，PTX-DSF约为48％。在某种程度上，DSF单独作用也可以诱导细胞系的凋亡。本专利技术可导致A549和A549/TAX细胞周期的停止，PTX通过降低G0/G1期细胞的比例，和提高G2/M期细胞比例产生细胞毒素。此外，DSF显著降低A549细胞在G0/G1期的细胞比例，提高G2/M期细胞比例。与PTX相比，联合剂型PTX-DSF和PTX-DSFNs进一步提高了A549G2/M期细胞比例。联合PTX和DSF产生了大量的细胞毒素显著影响了A549细胞系，尤其是耐紫杉醇的癌症细胞。因此，本剂型可以降低G0/G1期细胞的比例，使细胞周期停止。与单一PTX相比，杂交纳米悬浮剂在A549细胞中，显著上调caspase-3表达，caspase-9表达则被PTX-DSFNs上调。相似的提高caspase-3表达也可以在经过PTX-DSF和PTX-DSFNs处理的A549/TAX细胞中发现。PTX-DSFNs上调caspase-3和caspase-9表达程度比PTX-DSF更大，说明PTX-DSFNs有促进两种药物协同作用的效果。本专利技术显著下调了MDR-1的表达大约2.4倍。因此，A549/TAX细胞中下调MDR-1进一步改善了抑制效本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.Beta‑乳球蛋白均匀包裹的紫杉醇和戒酒硫杂交纳米悬浮剂(PTX‑DSF Ns)配制及鉴定如下：(1)Beta‑乳球蛋白(β‑LG)浓度为0.5‑2W/V。(2)双药(紫杉醇‑戒酒硫)浓度为1/0.1‑10/1W/W。(3)丙酮浓度为0.5‑2％。
【技术特征摘要】
1.Beta-乳球蛋白均匀包裹的紫杉醇和戒酒硫杂交纳米悬浮剂(PTX-DSFNs)配制及鉴定如下：(1)Beta-乳球蛋白(β-LG)浓度为0.5-2W/V。(2)双药(紫杉醇-戒酒硫)浓度为1/0.1-10/1W/W。(3)丙酮浓度为0.5-2％。2.PTX-DSFNs的直径为纳米级并带有负界达电位。3.稳定性研究在10％生理盐水、10％PBS(pH7.4)、10％PBS(pH7.4)+10％FBS中实施。纳米悬浮剂根据粒子大小、多分散性及界达电位判断可在多种溶液中稳定。4.PTX-DSFNs形态学研究使用电镜扫描及透射式电子显微镜观测，其形态为针状结构。5.结晶度通过PXRD分析得出，并与PTX、DSF、β-LG和PTX-DS...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹莉芳，何伟，伊木朗，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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