一种核酸稳定的荧光银纳米团簇、制备方法及其在赭曲霉毒素检测的应用技术

本发明专利技术一种核酸稳定的荧光银纳米团簇、制备方法及其在赭曲霉毒素检测的应用，其方法为：设计两种类型的核酸稳定的银纳米团簇（AgNCs），连接在DNA稳定的AgNCs上的序列可以是毒素的适配体序列，当连接在DNA稳定的AgNCs上的序列为赭曲霉毒素（OTA）的适配体时，在OTA存在的条件下，OTA与DNA稳定的AgNCs一端的适配体结合的作用力大于单链DNA与WS2之间的作用力，使得AgNCs从WS2上脱离，进而恢复荧光。此外，当溶液中含有两种不同毒素的适配体连接发不同的光的DNA稳定的AgNCs时，同时加入两种检测目标物，可实现两种毒素的同时检测；该方法的选择性好，灵敏度高，成本低；其检测OTA和AFB1的检测下限分别为：0.5ng/mL、0.5ng/mL。

Nucleic acid stabilized fluorescent silver nanocluster, preparation method and its application in detection of ochratoxin

The present invention is a nucleic acid stable fluorescent silver nanocluster, preparation method and application in ochratoxin detection. The method is to design two types of nucleic acid stable silver nanoclusters (AgNCs). The sequence connected to the stable AgNCs of DNA can be the sequence of toxin's aptamer, when connected to the stable AgNCs of DNA. When the sequence is the aptamer of ochratoxin (OTA), under the presence of OTA, the binding force of OTA to the aptamer at the AgNCs end of the DNA is greater than that between the single chain DNA and the WS2, leaving AgNCs out of the WS2 and restoring the fluorescence. In addition, when the solution contains two different toxin aptamers connecting with different light DNA stable AgNCs, adding two detection targets at the same time, the two toxins can be detected simultaneously. The method has good selectivity, high sensitivity and low cost, and the detection limits of OTA and AFB1 are 0.5ng/mL and 0.5ng/mL, respectively. .

【技术实现步骤摘要】
一种核酸稳定的荧光银纳米团簇、制备方法及其在赭曲霉毒素检测的应用
本专利技术属于纳米复合材料研究领域，特别涉及一种利用特定的核酸序列为模板制备稳定的具有荧光的银纳米团簇复合材料的制备方法，这种材料结合二硫化钨类似于石墨烯的纳米二维层状结构的性质用于新型的对多种毒素同时检测的荧光型生物传感器，所述的核酸稳定的银纳米团簇可记作AgNCs。
技术介绍
动物饲料和人食物中的霉菌毒素对动物和人体的健康有很大的危害，进而引发了全球人民对霉菌毒素检测的高度关注。赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1是最为普遍的两种的霉菌毒素。这两种毒素在天然食物（如谷类、豆类、干果、咖啡等）中最为多见，毒性也最强。现有技术中，法定的检测赭曲霉毒素A的方法有薄层色谱分析荧光检测（TLC-FD）和高效液相色谱荧光分析法(HPLC-FD)。传统定量检测黄曲霉毒素B1的方法有色谱分析法、液相色谱-质谱法等。然而，这些方法需要高端的设备和复杂精细的操作方法。近年来，又发展了酶联免疫吸附测定（ELISA）、电化学分析、表面等离子体共振（SPR)等方法用来检测食物中含有的赭曲霉毒素。尽管这些方法比较受欢迎，但这些方法都需要一个稳定的抗体来源，而且耗时还比较久、花费也比较高。因此，发展一种简单快速、低消耗、灵敏度高的检测方法来检测食品中赭曲霉毒素A或黄曲霉毒素B1的含量已迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种核酸稳定的荧光银纳米团簇的制备方法。本专利技术的第二个目的是提供一种核酸稳定的荧光银纳米团簇。本专利技术的第三个目的是提供一种基于所述的具有荧光的银纳米团簇复合材料在赭曲霉毒素检测的生物传感器的应用方法，该方法的选择性好，灵敏度高，成本低。为实现本专利技术的第一个目的，本专利技术的技术方案是信号探针与硝酸银在缓冲液体系中混合，以硼氢化钠为催化剂，避光的条件下反应合成核酸稳定的荧光银纳米团簇，所述的信号探针为探针P5，所述探针P5的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。进一步设置是信号探针的最终浓度为1.5μM。本专利技术的第二个专利技术目的是提供一种如所述的制备方法所制备的核酸稳定的荧光银纳米团簇，所述的信号探针为探针P5，则该银纳米团簇的荧光波段为红外光波段。实现本专利技术的第三个目的是提供一种核酸稳定的荧光银纳米团簇作为荧光探针分析食品中的毒素的方法，（1）将所述的核酸稳定的荧光银纳米团簇在缓冲液体系下，加入二硫化钨、以及分别加入用于标定的多组浓度的毒素溶液，待反应完毕，分别检测反应后体系的荧光强度，获得该荧光强度与用于标定的多组毒素溶液对数之间在浓度检测区间的线性比例关系；（2）将所述的核酸稳定的荧光银纳米团簇在缓冲液体系下，加入二硫化钨，以及加入待检测的毒素溶液，根据步骤（1）的线性比例关系确定待检测的毒素溶液的浓度。进一步设置是所述的核酸稳定的荧光银纳米团簇合成所用的信号探针为探针P5，所述的毒素溶液为OTA毒素溶液，所述的浓度检测区间为10ng/mL-200ng/mL。进一步设置是所述的核酸稳定的荧光银纳米团簇合成所用的信号探针为探针P6，所述的毒素溶液为AFB1毒素，所述的浓度检测区间为50ng/mL到1000ng/mL。本专利技术的创新机理是：（1）设计发红光(616nm)的核酸稳定的银纳米团簇（AgNCs）：由于胞嘧啶丰富的核酸序列稳定的AgNCs不能很好的吸附在WS2上，因此要连接一单链DNA序列在DNA稳定的AgNCs上，使其能够吸附在WS2上并淬灭AgNCs发射的荧光。连接在DNA稳定的AgNCs上的序列可以是毒素的适配体序列，本专利技术中分别为OTA毒素适配体链。如表1所示，探针P1序列能够与银离子作用，在还原剂硼氢化钠的存在下，还原成银纳米团簇。当激发波长为606nm时，在670nm左右有一个荧光吸收峰。探针P2序列也能够与银离子作用，在还原剂硼氢化钠的存在下，还原成银纳米团簇，当激发波长为763nm时，在820nm左右有一个荧光吸收峰。探针P3为OTA的核酸适配体序列，探针P4为AFB1的核酸适配体序列。探针5序列由P1序列和OTA的适配体序列组成，并能够与银离子作用，在还原剂硼氢化钠的存在下，还原成银纳米团簇，当激发波长为530nm时，在615nm左右有一个荧光吸收峰。表1方法中合成的核酸序列（5’→3’）（2）DNA稳定的AgNCs的制备方法：制备具有荧光的银纳米颗粒：体系中单链浓度为1.5μM。在总反应体系中，加入10mMPBS缓冲液，事先准备好的合成的AgNCs所需的信号探针，适量浓度的硝酸银溶液，混匀30s后静止15分钟，再加入适量浓度的硼氢化钠溶液混匀，避光的条件下反应12小时后，放在冰箱里待用。所述合成的AgNCs所需的信号探针分别为：表1中信号探针5和信号探针6。本专利技术核酸稳定的AgNCs作为荧光探针分析食品中的毒素：在总反应的体系中，加入20μL本专利技术所制得的AgNCs上述溶液、100μL的缓冲溶液、适量的WS2、适量的灭菌水、不同浓度的毒素溶液，50min后测荧光。在本专利技术中AgNCs在体系中的最终浓度为100nM。本专利技术的有益成果在于：（1）设计并制备的核酸稳定的发荧光的AgNCs，操作简单，易得；（2）制备的核酸稳定的发荧光的AgNCs结合二硫化钨类似于石墨烯纳米二维层状结构的性质，实现对多种毒素的灵敏检测。（3）制备的核酸稳定的发荧光的AgNCs结合二硫化钨类似于石墨烯纳米二维层状结构的性质，发展的新型传感器，无需标记，操作简单，耗时短，灵敏度高。综上所述：一方面本专利技术提供的核酸稳定的发荧光的AgNCs的制备方法，操作简单，易得，室温下即可完成，易于大规模生产；另一方面，将制得的核酸稳定的发荧光的AgNCs结合二硫化钨应用于检测毒素的生物传感器，可以实现对毒素的灵敏检测。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本专利技术的范畴。图1本专利技术制备核酸稳定的AgNCs结合二硫化钨应用于多种毒素同时检测的原理图；图2本专利技术实施例1制得的发红外光的AgNCs结合二硫化钨应用于生物传感器中，在不同的OTA浓度时，荧光强度的变化。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步地详细描述。实施例1：发红外光的AgNCs的制备及在生物传感器中的应用（1）合成DNA稳定的发红外光的AgNCs制备具有荧光的银纳米颗粒：体系中单链浓度为1.5μM。在总反应体系中，加入10mMPBS缓冲液，事先准备好的合成的发红外光的AgNCs所需的信号探针P5，适量浓度的硝酸银溶液，混匀30s后静止15分钟，再加入适量浓度的硼氢化钠溶液混匀，避光的条件下反应12小时后，放在冰箱里待用。（2）采用DNA稳定的发红外光的AgNCs作为荧光探针，分析食品中的OTA毒素在总反应的体系中，加入20μL发红外光的AgNCs上述溶液、100μL的缓冲溶液、适量的WS2、适量的灭菌水、不同浓度的OTA毒素溶液，50min后测荧光。图2为本实施例制得的发红外光的AgNCs结合二硫化钨应用于生物传感器中，在不同的OTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸稳定的荧光银纳米团簇的制备方法，其特征在于：信号探针与硝酸银在缓冲液体系中混合，以硼氢化钠为催化剂，避光的条件下反应合成核酸稳定的荧光银纳米团簇，所述的信号探针为探针P5，所述探针P5的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

【技术特征摘要】
1.一种核酸稳定的荧光银纳米团簇的制备方法，其特征在于：信号探针与硝酸银在缓冲液体系中混合，以硼氢化钠为催化剂，避光的条件下反应合成核酸稳定的荧光银纳米团簇，所述的信号探针为探针P5，所述探针P5的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。2.根据权利要求1所述的核酸稳定的荧光银纳米团簇的制备方法，其特征在于：信号探针的最终浓度为1.5μM。3.一种如权利要求1所述的制备方法所制备的核酸稳定的荧光银纳米团簇，其特征在于：所述的信号探针为探针P5，则该荧光银纳米团簇的荧光波段为红外光波段。4.一种核酸稳定的荧光银纳米团簇作为荧光探针分析食品中的赭曲霉毒素的方法，其特征在于：（...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂华贵，王宇，来倩倩，杨植，顾灿灿，黄少铭，
申请(专利权)人：温州大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33