The invention discloses a synchronous detection and identification method for three main pathogenic nematodes in tobacco root knot nematode disease. Including PCR primer design, DNA template preparation, PCR amplification, product detection steps. This invention has designed 6 PCR primers for the species identification of the 3 root knot nematodes of the southern root knot nematode, peanut root knot nematode and Java root knot nematode. The identification has good stability and high accuracy. The combined use of 6 primers can achieve 3 tobacco root knot lines with 1 PCR reactions. The synchronous detection of the pathogenic nematode of the insect disease is convenient and time-saving; the common PCR instrument and the conventional reagents are used to detect the cost, which is beneficial to the application. The invention includes the design of the DNA preparation method for the root samples and soil samples, which can be taken as the target of the root knot nematode, including the eggs, larvae and adults. It has a wide range of use.
【技术实现步骤摘要】
一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法
本专利技术属于植物病害病原检测
,具体涉及一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法。
技术介绍
根结线虫(Meloidogynespp.)是植物病原线虫中种类最多、分布最广和危害最严重的一类线虫。这类线虫主要以土壤传播的形式,危害植物的根系,使受害植物的根部形成肿瘤状的根结,从而发生严重影响植物正常生长发育的根结线虫病,已知受根结线虫病危害的植物主要包括茄科、豆科、葫芦科、禾本科、伞形花科等3000多种,在温带、亚热带和热带地区的植物受害尤其严重。其中尤以烟草受根结线虫危害最为严重,据联合国粮农组织估计,发达国家因根结线虫造成的烟草损失平均每年为4%,全世界的平均损失估计为10%,发展中国家的损失超过25%。在我国自20世纪80年代中后期以来,烟草根结线虫病病区不断扩大,危害加重,在河南、山东、云南、贵州、四川、湖北等烟区发生较为普遍,危害较重,病区发病率一般为70%-100%,重者达90%以上,减产30%-70%,成为了我国烟草生产上的主要病害。根结线虫属于土壤习居性生物,由于受到土壤环境的限制外部施加的物理、化学因素很难对根结线虫起作用,尤其是近年来,用于根结线虫病防治的多数化学杀线虫剂存在高毒、高残留的弊端,已在世界范围内被普遍禁用。因此采取安全高效的根结线虫病防控方法已成为大势所趋。在烟草根结线虫病的防控过程中,选择采用合适的抗病烟草品种被认为是一项经济、高效、绿色的措施。然而,根结线虫种类繁多,不同根结线虫对寄主植物的致病能力不同,抗病品种对根结线虫的抗性范围也有限,当前 ...
【技术保护点】
1.一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法,其特征在于包括PCR引物设计、DNA模板制备、PCR扩增、产物检测步骤,具体包括:A、PCR引物设计:根据南方根结线虫、花生根结线虫和抓哇根结线虫的种类特异性序列设计6条PCR引物,即TR1、TR2、TR3、TR4、TR5和TR6用于上述3种根结线虫PCR鉴定,其序列分别为:TR1:5'‑AAGCAAAAGACGAAGCACCAAAA‑3'TR2:5'‑GAGGATTCAGCTCCCCAGCAC‑3'TR3:5'‑GAGTACGGATTTGAAATACAGGG‑3'TR4:5'‑TGAATGCTATGCCATCAGGAG‑3'TR5:5'‑CGATTGAACTGAGCCCAGACT‑3'TR6:5'‑TTTATTCGCAAGACAACACCC‑3';B、DNA模板制备:在检测烟草病根样品时:将病根样品表面的附着物去除,挑取根结线虫卵块或根结组织置于灭菌后的研钵中,加入液氮研磨成粉末转入离心管中,加入DNA提取缓冲液,置于50~60℃水浴保温50~70min,冷却至室温,用等体积的酚‑氯仿‑异戊醇混合溶剂和氯仿‑异戊醇混合溶剂依 ...
【技术特征摘要】
1.一种烟草根结线虫病中三种主要病原线虫的同步检测鉴定方法,其特征在于包括PCR引物设计、DNA模板制备、PCR扩增、产物检测步骤,具体包括:A、PCR引物设计:根据南方根结线虫、花生根结线虫和抓哇根结线虫的种类特异性序列设计6条PCR引物,即TR1、TR2、TR3、TR4、TR5和TR6用于上述3种根结线虫PCR鉴定,其序列分别为:TR1:5'-AAGCAAAAGACGAAGCACCAAAA-3'TR2:5'-GAGGATTCAGCTCCCCAGCAC-3'TR3:5'-GAGTACGGATTTGAAATACAGGG-3'TR4:5'-TGAATGCTATGCCATCAGGAG-3'TR5:5'-CGATTGAACTGAGCCCAGACT-3'TR6:5'-TTTATTCGCAAGACAACACCC-3';B、DNA模板制备:在检测烟草病根样品时:将病根样品表面的附着物去除,挑取根结线虫卵块或根结组织置于灭菌后的研钵中,加入液氮研磨成粉末转入离心管中,加入DNA提取缓冲液,置于50~60℃水浴保温50~70min,冷却至室温,用等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂和氯仿-异戊醇混合溶剂依次抽提,取上清液加等体积的异丙醇沉淀,沉淀经体积百分浓度60~80%的乙醇溶液清洗并干燥后,溶于灭菌纯净水中,调节DNA浓度值50ng/μl,得到用于PCR检测的DNA模板制备液;在检测样品为烟草根际土壤时:取土壤样品采用常规方法进行土壤线虫分离,将得到的线虫悬浮液置于解剖镜下观察,挑取其中疑似根结线虫二龄幼虫或雄成虫的线虫2~3条至10μl的100ng/μ的蛋白酶K溶液中,用解剖针将线虫切断,60℃水浴1h后95℃加热10min,冷却至室温即得用于PCR检测的DNA...
【专利技术属性】
技术研发人员:李梅云,吴文涛,宋中邦,张靖,曾建敏,王扬,王丙武,焦芳婵,高玉龙,吴兴富,李永平,李文正,
申请(专利权)人:云南省烟草农业科学研究院,
类型:发明
国别省市:云南,53
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