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检测环状RNAcircRNF13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用制造技术

技术编号:18489911 阅读:42 留言:0更新日期:2018-07-21 16:23
本发明专利技术公开了检测环状RNA circRNF13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用。特别是实时荧光定量分析法辅助诊断舌鳞癌的制剂。通过研究证实circRNF13在舌鳞癌组织中表达下调。因此,将circRNF13的表达情况用于舌鳞癌的辅助诊断,具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Application of reagents for detecting cyclic RNAcircRNF13 in the preparation of adjuvant diagnostic preparations for tongue squamous cell carcinoma

The invention discloses a reagent for detecting cyclic RNA circRNF13 in the preparation of auxiliary diagnostic preparation for tongue squamous cell carcinoma. In particular, real-time fluorescence quantitative analysis is used to assist in the diagnosis of tongue squamous cell carcinoma. Studies have confirmed that circRNF13 expression is downregulated in tongue squamous cell carcinoma. Therefore, the expression of circRNF13 in the diagnosis of tongue squamous cell carcinoma has far-reaching clinical significance and important application prospects.

【技术实现步骤摘要】
检测环状RNAcircRNF13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域,具体涉及检测环状RNAcircRNF13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用。
技术介绍
人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(TheEncyclopediaofDNAElementsProject,ENCODE)研究成果表明,蛋白编码基因序列仅占人类基因组序列的1-3%,而人类基因组中绝大部分可转录的序列为非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)。非编码RNA尽管不编码蛋白质,但由于广泛参与了细胞内基因表达调控,在生物医学研究领域一直备受关注。研究得较多的是线性的ncRNA分子,从RNA序列长短可分为微小RNA(microRNA,miRNA,19-23nt)和长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNAs,>200nt),它们在包括恶性肿瘤在内的多种人类常见疾病的发生发展中发挥着重要的功能。最近,一类全新的ncRNA分子,环状RNA(circularRNA,circRNA)由于其独特的构型和被日益发现的重要生物学功能,已经成为生物医学领域新的前沿和热点。circRNA曾一度被当做基因转录后加工过程中的错误产物。和mRNA及lncRNA等线性RNA的加工过程很相似,circRNA的形成也是由剪接复合体对RNA前体进行剪接加工时生成的,只不过在这一过程中,侧翼的成环序列首先结合成环,随后剪接复合体进行剪接,最终将侧翼序列切除形成circRNA。近年来随着测序技术尤其是RNA-seq等新一代测序技术的发展,越来越多的circRNA被人们发现,并已经通过研究揭示了部分circRNA在众多的生命活动中都发挥着重要的作用。此外由于其独特的结构导致circRNA对核酸酶不敏感,在肿瘤标志物的开发应用方面circRNA也具有明显优势,因此极有可能作为一种重要的分子标志物和新兴的药物开发的靶点。但由于本领域刚刚兴起,大部分circRNA尚未被发现或者尚无研究。舌鳞状细胞癌(tonguesquamouscellcarcinoma,TSCC)是发病率最高的口腔恶性肿瘤,舌鳞癌多数为鳞癌,多发生于舌缘,其次为舌尖、舌背及舌根等处,常为溃疡型或浸润型。一般恶性程度较高,生长快,浸润性较强,常波及舌肌,致使舌运动受限,使说话、进食及吞咽均发生困难。手术治疗辅以顺铂类药物为主的化疗是舌鳞癌临床上主要的治疗方案。然而,在临床中发现舌鳞癌患者的治疗效果往往不理想,5年生存率仅为55-65%,究其原因主要在于手术残留的癌细胞(比如已经侵袭转移到了血管或淋巴管中的循环肿瘤细胞)普遍存在的耐药,导致肿瘤的复发和转移,引起治疗失败。因此,找出舌鳞癌细胞对化疗药物的抵抗机制,筛选新的药物作用靶点,最终提高患者生存率和生存质量,是值得临床科研工作者们研究的重要课题。为了研究circRNA在舌鳞癌细胞对顺铂类药物耐药中的作用和机制,我们使用Agilent公司的circRNA基因芯片ArraystarHumanCircularRNAMicroarrayV2.0对两对顺铂处理前后的舌鳞癌细胞株(Tca8113和Cal27)中circRNAs的表达情况进行了分析。我们发现circRNF13的表达变化最为显著,提示circRNF13可能和舌鳞癌的顺铂耐药相关,而到目前为止,circRNF13的生物学功能和作用机制未见任何报道。由于基因芯片只能基于circRNA环状拼接位点上下游序列设计探针,通过这些探针特异性捕获circRNA,从而检测细胞或组织中circRNA的表达丰度;具体对于我们通过circRNA芯片发现的circRNF13来说,通过基因芯片提供的技术资料我们能查到其对应的探针共60bp,前一段是RNF13基因的8号外显子3’末端30bp的序列,而后一段则是RNF13基因2号外显子5’末端30bp,提示它是由RNF13基因转录的前体RNA的2号和8号外显子首尾相连加工而成,但具体是RNF13哪几个外显子加工产生(是不是2~8号外显子全部包括在内?是否还包含内含子序列?因为有的circRNA就包括内含子序列)并不清楚。随后,我们设计引物并通过两次嵌套的PCR成功克隆了circRNF13的全长序列,证实了circRNF13确实是由位于染色体3q25.1区域上的RNF13基因(ringfingerprotein13,NM_183381.2)的第2-8号外显子环化拼接形成,全长为716bp。为了进一步研究circRNF13的生物学功能,我们设计了针对circRNF13的小分子干扰RNA(siRNA)序列特异性敲低了circRNF13的表达,同时成功构建了circRNF13过表达载体在舌鳞癌细胞中过表达circRNF13。MTT和流式细胞计数检测证实了上调circRNF13可以明显抑制舌鳞癌细胞增殖,其机制是阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡,而敲低circRNF13则得到了相反的结果。进一步地,我们通过诱导培养,成功地获得了舌鳞癌化疗耐药细胞株,实时定量PCR检测了细胞中circRNF13的表达水平,发现circRNF13在耐药细胞株中的表达与原始细胞株相比显著下调了;而我们在耐药细胞中过表达circRNF13,可以明显逆转舌鳞癌细胞的耐药表型,而在原始细胞株中敲低circRNF13的表达,则可以显著提高舌鳞癌细胞对顺铂的耐受。最后,我们在舌鳞癌临床样本中通过实时荧光定量PCR和原位杂交的方法检测了circRNF13的表达情况,发现circRNF13在舌鳞癌中表达显著下调,且circRNF13表达低的患者其生存时间短于circRNF13表达高的患者,因此针对该lncRNA的检测制剂也可以用于舌鳞癌的辅助诊断和预后判断。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供检测环状RNAcircRNF13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用。检测环状RNAcircRNF13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用,所述的环状RNAcircRNF13的序列如SEQNO:1所示。circRNF13RNA序列由于是一个环状RNA,序列表中只是展示了其完整数目的716bp序列,但实际该RNA首尾相连,无始无终。所述的检测环状RNAcircRNF13的试剂为实时荧光定量检测试剂。所述的实时荧光定量检测试剂中包含用于实时荧光定量检测circRNF13表达的引物序列:正向引物:5-GTCCAGGATAGACATAGAGC-3,反向引物:5-GTGTAGACTTGTGTGGCTGA-3。所述的实时荧光定量检测制剂为试剂盒,试剂盒中还含有:内参基因GAPDH特异性PCR引物:正向引物:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’反向引物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。试剂盒中还含有:(1)从舌鳞癌或正常组织中抽提总RNA所用试剂,包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水;(2)以总RNA为模板将LncRNAcircRNF13逆转录为cDNA所用试剂,包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及随机引物;(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂,包括实本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.检测环状RNA circRNF13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用,所述的环状RNA circRNF13的序列如SEQ NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.检测环状RNAcircRNF13的试剂在制备舌鳞癌辅助诊断制剂上的应用,所述的环状RNAcircRNF13的序列如SEQNO:1所示。2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的检测环状RNAcircRNF13的试剂为实时荧光定量检测试剂。3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的实时荧光定量检测试剂中包含用于实时荧光定量检测circRNF13表达的引物序列:正向引物:5-GTC...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘凌云郭灿熊芳曾朝阳熊炜张姗姗龚朝建王裕民莫勇真李夏雨李小玲李桂源
申请(专利权)人:中南大学
类型:发明
国别省市:湖南,43

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