一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用，所述单加氧酶突变体具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的23至508位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1‑34个氨基酸；其中，所述突变体具有单加氧酶的活性。本发明专利技术中通过设计23至508位氨基酸的多个不同位点的突变，发现这些突变体提高了单加氧酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低单加氧酶的使用量。

Monooxygenase mutant and preparation method and application thereof

The present invention relates to the field of genetic engineering, in particular a monooxygenase mutant and its preparation method and application. The monooxygenase mutant has one of the amino acid sequences shown by (I) and (II): the amino acid sequence of the amino acid sequence shown by (I) and SEQ ID NO.1 has at least 80% identical amino acid sequences; (II) and SEQ I The amino acid sequence of the amino acid sequence shown by D NO.1 is modified, replaced, missing or added one or a few amino acids, which is substituted for the substitutions of 1 amino acids and 34 amino acids, in which the mutant has the activity of the monooxygenase. In the present invention, by designing multiple dislocations of 23 to 508 amino acids, these mutants have found that these mutants increase the activity, stability, soluble expression and selectivity of the monooxygenase, and can also reduce the use of monooxygenase.

【技术实现步骤摘要】
一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
手性亚砜广泛存在于自然界中，是很多重要生物活性分子的结构单元，是合成天然产物和手性药物的重要中间体。许多手性亚砜都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的，甚至是有毒的。因此，如何高效立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。BaeyerVilliger单加氧酶(BVMOs)属于黄素类单加氧酶，通常用来立体选择性氧化链状和环状的酮，生成相应的酯或内酯，也能催化硫、氮和磷的亲电氧化反应，同时BVMOs还能催化酮和硼的亲核氧化反应。环己酮单加氧酶(CHMOs)是第一个被发现的BVMO家族成员。CN105695425A公开了CHMOs在手性药物的合成方面具有很大的应用，可以催化含硫手性前体的氧化，被用于手性药物莫达非尼和奥美拉唑的合成中，但现有的CHMOs酶活性低，稳定性差，可溶表达不好，选择性不高，酶添加量大，后处理困难。来源于单胞菌Brachymonaspetroleovorans的单加氧酶CHMO可以较高选择性的催化硫醚类化合物的转化，但是其活性较低，稳定性较差，在大肠杆菌中可溶表达不好，反应时添加的酶量较多。CN107384880A公开了一种黄素单加氧酶突变体及其制备方法，该方法使用易错PCR技术，对野生型黄素单加氧酶进行随机突变，得到黄素单加氧酶突变体，比酶活较野生型黄素单加氧酶的比酶活提高了35％。但其仅仅是提高了比酶活，对单加氧酶的稳定性、可溶性表达、选择性和酶的使用量并没有起到作用。尽管有几种CHMOs得到了商业化应用，但CHMOs普遍存在着可溶性表达不好，酶活性低，酶稳定性低，选择性不高等问题。一般而言，可以通过定向进化的手段对野生酶进行改造，提高酶的各种性质，从而可以应用在生产中。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用，所述单加氧酶突变体，提高了其转化效率，稳定性，有利于其在制药领域中的应用。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种单加氧酶突变体，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的23至508位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1-34个氨基酸；其中，所述突变体具有单加氧酶的活性。本专利技术中，专利技术人通过设计23至508位氨基酸的多个不同位点的突变，从而对单加氧酶的性质进行考察，发现这些位点的突变会提高单加氧酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低酶的使用量。本专利技术中，所述SEQIDNO.1所示的氨基酸序列如下：MSSSPSSAIHFDAIVVGAGFGGMYMLHKLRDQLGLKVKVFDTAGGIGGTWYWNRYPGALSDTHSHVYQYSFDEAMLQEWTWKNKYLTQPEILAYLEYVADRLDLRPDIQLNTTVTSMHFNEVHNIWEVRTDRGGYYTARFIVTALGLLSAINWPNIPGRESFQGEMYHTAAWPKDVELRGKRVGVIGTGSTGVQLITAIAPEVKHLTVFQRTPQYSVPTGNRPVSAQEIAEVKRNFSKVWQQVRESAVAFGFEESTVPAMSVSEAERQRVFQEAWNQGNGFYYMFGTFCDIATDPQANEAAATFIRNKIAEIVKDPETARKLTPTDVYARRPLCDSGYYRTYNRSNVSLVDVKATPISAMTPRGIRTADGVEHELDMLILATGYDAVDGNYRRIDLRGRGGQTINEHWNDTPTSYVGVSTANFPNMFMILGPNGPFTNLPPSIEAQVEWITDLVAHMRQHGLATAEPTRDAEDAWGRTCAEIAEQTLFGQVESWIFGANSPGKKHTLMFYLAGLGNYRKQLADVANAQYQGFAFQPL.在本专利技术的另一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。在本专利技术的一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。在本专利技术的一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。在本专利技术的一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。本专利技术中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化中的任意一种或至少两种的组合。所述取代例如可以是取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个或34个。本专利技术中，所述单加氧酶突变体能够催化硫醚类化合物进行转化，所述硫醚类化合物为其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，所述硫醚类类化合物如式I所示；具体反应式如下：根据本专利技术，所述取代为第23位、第25位、第47位、第75位、第93位、第106位、第110位、第117位、第137位、第153位、第159位、第166位、第260位、第265位、第284位、第289位、第334位、第359位、第360位、第377位、第380位、第426位、第428位、第435位、第436位、第437位、第439位、第457位、第474位、第479位、第490位、第495位、第500位或第508位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。根据本专利技术，所述突变体的突变位点为M23L、M25A、A74D、M75L、A93E、P106R、L110F、M117A、T137R、W153F、R159L、M166L、M260L、A265E、M284I、C289S、C334L、A359E、M360I、M377V、L380F、M426L、M428F、P435L、P435A、F436L、F436Y、F436A、T437S、T437A、T437Y、L439G、L439A、L439S、M457L、A474E、C479V、Q490K、I495F、I495V、I495A、S500I或M508L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单加氧酶突变体，其特征在于，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的23至508位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1‑34个氨基酸；其中，所述突变体具有单加氧酶的活性。

【技术特征摘要】
1.一种单加氧酶突变体，其特征在于，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的23至508位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1-34个氨基酸；其中，所述突变体具有单加氧酶的活性。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述取代为第23位、第25位、第47位、第75位、第93位、第106位、第110位、第117位、第137位、第153位、第159位、第166位、第260位、第265位、第284位、第289位、第334位、第359位、第360位、第377位、第380位、第426位、第428位、第435位、第436位、第437位、第439位、第457位、第474位、第479位、第490位、第495位、第500位或第508位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代；优选地，所述突变体的突变位点为M23L、M25A、A74D、M75L、A93E、P106R、L110F、M117A、T137R、W153F、R159L、M166L、M260L、A265E、M284I、C289S、C334L、A359E、M360I、M377V、L380F、M426L、M428F、P435L、P435A、F436L、F436Y、F436A、T437S、T437A、T437Y、L439G、L439A、L439S、M457L、A474E、C479V、Q490K、I495F、I495V、I495A、S500I或M508L中的任意一个或至少两个的组合。3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述取代为第25位、第106位、第159位、第265位、第289位、第377位、第380位、第435位、第436位、第437位、第439位、第474位、第479位、第490位、第495位或第500位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代；优选地，所述突变体的突变位点为M25A、P1...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯·盖吉，卢江平，焦学成，张娜，李瑞，张克俭，张瑜，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12