用于利用结构化的光片照射检查试样的方法和设备技术

技术编号:18465606 阅读:35 留言:0更新日期:2018-07-18 15:48
本发明专利技术涉及一种用于用显微镜检查试样(24)的方法和设备。所述方法包括:利用光源产生照射光束(2)的步骤、利用分裂器件(1)将照射光束(2)在空间上分裂成至少两个子照射光束(3、4)的步骤、通过一个对于两子照射光束(3、4)共用的照射透镜(7)引导子照射光束(3、4)的步骤、在子照射光束(3、4)已经穿过照射透镜(7)之后利用至少一个转向机构(27)使所述子照射光束之中的至少一个子照射光束转向,使得子照射光束(3、4)在一个照射平面(11)中相互干涉,从而在照射平面(11)产生一个照射图案(12)的步骤,和产生由照射图案(12)照射的试样区域的图像的步骤,其中,从试样区域出来的检测光通过检测透镜(8)到达位置分辨的检测器。

Method and apparatus for inspecting specimens using structured light irradiation

The invention relates to a method and an apparatus for inspecting a sample (24) with a microscope. The methods include: a step of generating a beam of light (2) using a light source, the step of splitting the irradiated beam (2) in space into at least two sub irradiated beams (3, 4) by using a split device (1), the step of irradiating a beam (3, 4) by a radiating mirror (7) guide (3, 4) shared by the two beams (3, 4), and the irradiation beam (3). In the light of the irradiation lens (7), at least one of the sub irradiated beams in the irradiated beam is turned through at least one steering mechanism (27), so that the sub irradiation beam (3, 4) interfered with each other in a radiation plane (11), thus producing a radiation pattern (12) in the radiation plane (11), and producing the radiation diagram. Case (12) the step of the image of the sample area irradiated, wherein the detected light coming out of the sample area reaches the position resolved detector through the detection lens (8).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于利用结构化的光片照射检查试样的方法和设备
本专利技术涉及一种用于检查试样、尤其是在光片显微镜中检查试样的方法和设备。
技术介绍
在SPIM技术(选择性光片照明显微镜)中进行层式照射试样,该SPIM技术允许比例如在点式扫描试样时更快速地并且更珍惜试样地检测图像数据。SPIM技术的已知的应用领域是荧光显微镜领域,其中,利用激光激励在试样中的荧光。在这里,在SPIM技术中仅仅在一个照射光片(也称为“光带”)中发生激励。由此避免了在其它平面中的照射光损坏试样。根据SPIM技术工作的光学设备在DE10257423A1中有所描述。在该显微镜中利用薄的光片照射试样,而从垂直于照射光片的平面的方向进行观察。在这里,照射和检测经由两个单独的光路利用相应单独的光学装置进行。光片由圆柱透镜产生。为了拍摄照片,使试样运动通过关于检测器固定的光片,以便层式地利用一个面状的检测器拍摄荧光和/或散射光。接着,如此获得的层图像数据可以组合成一个与试样的三维图像相应的数据组。由DE102007015063A1已知一种光学配置系统,其包括用于发射光束的光源并且包括用于将该光束转变成光片形状的光学元件。该光学配置系统尤其是适合于在选择性光片照明显微镜(SPIM)中照射三维试样的个别平面。设有用于改变光片横截面的、用于改变光片长度的和/或用于影响在光片之内延伸的光线部分的方向的器件,以便能在利用多个不同类型的物镜观察同一个试样平面时按照射要求实现光片的几何结构的匹配。代替直接照射试样,也可以以渐逝波的方式照射试样。在这里,激励光在与试样的界面上全反射,其中,通过随着进入深度渐渐消失的渐逝波的电磁场激励试样。对于这种类型的试样检查,已经引入概念TIRF显微镜(全内反射荧光显微镜、内部全反射荧光显微镜)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于,提供一种用于检查试样的方法,该方法在图像质量改善的情况下允许能良好地接近试样。所述目的通过一种方法实现,该方法的特征在于如下步骤:a.利用光源产生照射光束,b.利用分裂器件将照射光束在空间上分裂成至少两个子照射光束,c.通过一个对于两子照射光束共用的照射透镜引导子照射光束,d.在子照射光束已经穿过照射透镜之后利用至少一个转向机构使所述子照射光束之中的至少一个子照射光束转向,使得子照射光束在一个照射平面中相互干涉,从而在照射平面产生一个照射图案,和e.产生由照射图案照射的试样区域的图像,其中,从试样区域出来的检测光通过检测透镜到达位置分辨的检测器。本专利技术的另一目的在于给出一种用于检查试样的设备,该设备在图像质量改善的情况下允许能良好地接近试样。该目的通过一种设备实现,该设备包括:a.产生照射光束的光源,b.分裂器件,该分裂器件将照射光束在空间上分裂成至少两个子照射光束,c.照射物镜,该照射物镜被子照射光束穿过,d.至少一个转向机构,该转向机构在子照射光束已经穿过照射物镜之后使所述子照射光束之中的至少一个子照射光束转向,使得子照射光束在照射平面中相互干涉,从而在照射平面中产生照射图案,和e.位置分辨的检测器,用于产生由照射图案照射的试样区域的图像,其中,从试样区域出来的检测光通过检测物镜到达位置分辨的检测器。本专利技术具有相当特别的优点,即,通过利用照射图案照射,在光片显微镜中和/或在TIRF显微镜中能实现改善图像质量。这一方面通过如下方式,即,通过利用通过至少两个子照射光束的干涉产生的照射图案照射,至少能实现抑制背景。尤其是,如在下文还将进一步详细描述的,还可以有利地甚至实现提高分辨率。在此,相当特别有利的是,用于产生照射图案用来干涉的各子照射光束穿过同一照射物镜,从而在试样的区域内仅需要设置一个唯一的照射物镜,这能实现试样的特别良好的可接近性。虽然原理上已知在远场显微镜或TIRF显微镜中通过结构化的照射提高在显微镜中的侧向分辨率和图像对比度。但通过检测物镜的照射具有如下缺点,即,干涉图案的可能的入射角因而以及可能的周期由于检测物镜的数值孔径很受限制。迄今为止,在SPIM显微镜中通过结构化的照射在图像平面中各向同性的或者说沿着所有三个空间方向各向同性的分辨率提高是未知的。通常适用的是,分辨率提高取决于格栅的周期。当利用格栅通过检测物镜实现照射时,这大多以这种方式实现,即,照射光相对于光轴以陡峭的角度沿着两个相向的方向入射到试样体积中,从而产生驻波作为干涉图案,该驻波的周期取决于两条光线之间的角度2α。在此,角度α=arcsin(NA/n)尤其是取决于检测物镜的数值孔径(NA)和介质的折射率。典型地,在水(n=1.33)中NA<1.2并且因而α<65度。在各种情况下,角度α明显小于90度,其中,90度的角度本是最佳的,以便实现干涉图案的最小周期。不利地,干涉用的光束在其到达检测物镜的焦点平面之前和之后透射试样的大部分并且在那里、亦即在检测物镜(在TIRF中外部)的焦点平面上方和下方激励荧光,这在图像中引起明显的背景信号,在那里不必要地使试样的荧光变淡并且由于光毒性效应损坏试样。按照本专利技术,这些缺点在试样的SPIM检查中有利地得到避免或者减少。在这里,尤其是为了提高分辨率,甚至可以通过叠加2、3或者还要更多数量的子照射光束产生照射图案,而不需要同样多数量的照射物镜。适用多个照射物镜将会是昂贵的、复杂的并且易受干扰的。忽略这一点,几乎不可能将一个对于实现高分辨率必需的检测物镜与多个、例如四个照射物镜在空间上这样组合,使得照射物镜能将必需的子照射光束聚焦到检测物镜的焦点平面中,因为高孔径的物镜具有大的直径并且要求短的工作距离,从而当不使用特定的并且由此昂贵的具有特别大工作距离和典型小的数值孔径的照射物镜时,发生物镜在空间上的碰撞。在使用多个照射物镜时另一困难将会在于,高孔径的物镜也操纵光的极化,从而这导致子照射光束的不完全的干涉,由此例如不强烈地影响照射图案的零位和/或照射图案的对比度总体上减小,这对于图像质量是不利的。本专利技术避免这些缺点。尤其是为了产生在图像平面中各向同性叠加的图像,可以在照射平面中在时间上相继产生不同的和/或不同定位的和/或不同定向的照射图案,利用所述照射图案相应地照射同一试样区域。据此可以将按这种方式产生的图像的数据相互结算,用以总体上实现分辨率提高。为此可以使照射图案例如在格栅常数方面和/或在其位置方面和/或在其定向方向按不同的方式改变,以便相应地产生改变的照射图案。例如可以改变子照射光束的相对相位。这例如可以通过改变干涉的子照射光束的部分数量的光程来实现。替代地或附加地,也可以改变干涉的子照射光束的入射方向。这例如可以通过如下方式实现,即,使子照射光束在它们干涉之前分别利用多个不同设置的转向机构或一个转向机构的不同设置的转向元件转向,从而干涉的子照射光束分别从不同的方向入射,这更在下文还要更详细地阐述。替代地或附加地,也可以改变干涉的子照射光束到照射平面上的入射角,尤其是以便改变例如格栅常数。在按照本专利技术的方法的一种相当特别有利的实施方案中,除了所述照射图案之外还产生一个另外的照射图案,该另外的照射图案相干地或非相干地叠加于所述照射图案。例如,一个另外的照射图案可以通过如下方式产生,即,由照射光束分裂出至少两个另外的子照射光束,所述另外的子照射光束在照射平面中相本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.用于检查试样(24)的方法,尤其是在光片显微镜中,其特征在于如下步骤:a.利用光源产生照射光束(2),b.利用分裂器件(1)将照射光束(2)在空间上分裂成至少两个子照射光束(3、4),c.通过一个对于两子照射光束(3、4)共用的照射透镜(7)引导子照射光束(3、4),d.在子照射光束(3、4)已经穿过照射透镜(7)之后利用至少一个转向机构(27)使所述子照射光束之中的至少一个子照射光束转向,使得子照射光束(3、4)在一个照射平面(11)中相互干涉,从而在照射平面(11)产生一个照射图案(12),和e.产生由照射图案(12)照射的试样区域的图像,其中,从试样区域出来的检测光通过检测透镜(8)到达位置分辨的检测器。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.09 DE 102015117274.71.用于检查试样(24)的方法,尤其是在光片显微镜中,其特征在于如下步骤:a.利用光源产生照射光束(2),b.利用分裂器件(1)将照射光束(2)在空间上分裂成至少两个子照射光束(3、4),c.通过一个对于两子照射光束(3、4)共用的照射透镜(7)引导子照射光束(3、4),d.在子照射光束(3、4)已经穿过照射透镜(7)之后利用至少一个转向机构(27)使所述子照射光束之中的至少一个子照射光束转向,使得子照射光束(3、4)在一个照射平面(11)中相互干涉,从而在照射平面(11)产生一个照射图案(12),和e.产生由照射图案(12)照射的试样区域的图像,其中,从试样区域出来的检测光通过检测透镜(8)到达位置分辨的检测器。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述照射平面(11)中相继产生不同的和/或不同定位的和/或不同定向的照射图案(12、13),并且在此分别产生由照射图案(12、13)照射的试样区域的至少一个图像。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,将相继产生的图像进行结算和/或将相继产生的图像相互结算成一个高分辨的和/或对比度提高的图像。4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,不同的和/或不同定位的和/或不同定向的照射图案(12、13)通过a.改变子照射光束(3、4)的相位而产生,和/或通过b.改变干涉的子照射光束(3、4)的入射方向和/或通过c.改变干涉的子照射光束(3、4)到照射平面(11)上的入射角而产生。5.根据权利要求1至4之一所述的方法,其特征在于,a.由照射光束(2)产生至少两个另外的子照射光束,所述另外的子照射光束在照射平面中相互干涉,从而在照射平面(11)中产生另一照射图案(13),或者b.借助另一光源产生至少两个另外的子照射光束,所述另外的子照射光束在照射平面(11)中相互干涉,从而在照射平面(11)中产生另一照射图案(13)。6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,a.所述照射图案(12)和所述另一照射图案(13)在照射平面(11)中相干地叠加,或者b.所述照射图案(12)和所述另一照射图案(13)在照射平面(11)中非相干地叠加。7.根据权利要求1至6之一所述的方法,其特征在于,a.所述干涉的子照射光束(3、4)和/或所述另外的干涉的子照射光束构成为贝塞尔光束,和/或b.所述干涉的子照射光束(3、4)和/或所述另外的干涉的子照射光束构成为截面-贝塞尔光束。8.根据权利要求1至7之一所述的方法,其特征在于,a.每个子照射光束(3、4)和/或每个另外的干涉的子照射光束构成为光片,和/或b.每个子照射光束(3)和/或每个另外的干涉的子照射光束(4)聚焦到照射物镜(7)的入射光瞳中,和/或c.所述子照射光束(3、4)和/或所述另外的子照射光束在不同的入射角下和/或在不同的位置处聚焦到照射物镜(7)的入射光瞳中。9.根据权利要求1至8之一所述的方法,其特征在于,a.所述子照射光束(3、4)和/或所述另外的子照射光束在转向之后在照射平面(11)之内以不同的传播方向传播,和/或b.两个子照射光束(3、4)和/或两个另外的子照射光束在转向之后在照射平面(11)之内以彼此相反的传播方向传播,和/或c.照射平面(11)相对于照射物镜(7)的光轴具有不等于零度的角度,和/或d.照射平面(11)垂直于照射物镜(7)的光轴定向,和/或e.照射平面(11)相对于检测物镜(8)的光轴具有不等于零度的角度,和/或f.照射平面(11)垂直于检测物镜(8)的光轴定向。10.根据权利要求1至7之一所述的方法,其特征在于,所述试样(24)与光学透明的介质(25)接触,该介质具有比试样(24)高的折射率,并且所述子照射光束(3、4)和/或所述另外的子照射光束在光学透明的介质(25)与试样(24)之间的界面上干涉以产生照射图案(12)并且在那里全反射用于以渐逝波的方式照射试样(24)。11.根据权利要求1至10之一所述的方法,其特征在于,a.所述转向机构(29)或转向机构(29)的多个转向元件之中的至少一个转向元件设置和/或固定、尤其是可转动地设置和/或固定在检测物镜(8)上或在照射物镜(7)上,和/或b.所述转向机构(29)具有多个不同定向的转向元件,和/或c.每个子照射光束(3、4)和/或另外的子照射光束分别借助一个自己的转向元件转向。12.根据权利要求1至11之一所述的方法,其特征在于,所述转向机构(29)具有至少一个转向镜(9)和/或所述转向机构(29)的多个转向元件之中的至少一个转向元件构成为转向镜(9、10)。13.根据权利要求1至12之一所述的方法,其特征在于,所述照射物镜(7)的光轴和检测物镜(8)的光轴彼此(反)平行或同轴地定向,和/或所述检测物镜(8)和所述照射物镜(7)彼此相反地且彼此相对地定向。14.根据权利要求1至13之一所述的方法,其特征在于,在试样平面中使用所述照射图案(12...

【专利技术属性】
技术研发人员:F·法尔巴赫W·克内贝尔
申请(专利权)人:徕卡显微系统复合显微镜有限公司
类型:发明
国别省市:德国,DE

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