用于对试样的以荧光记号标记的结构高分辨率成像的方法和设备技术

技术编号:18465360 阅读:57 留言:0更新日期:2018-07-18 15:41
为了对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像,以光强度分布加载所述试样,在所述光强度分布中,聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值与聚焦的荧光阻抑光(19)的由一些强度极大值包围的强度极小值叠加成光强度分布(22)。在此,以所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值选择性地扫描所述试样的感兴趣的部分区域,其中,记录从所述试样发射的荧光(15)以及将其与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值在所述试样中的相应的位置相对应。对于所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值的相应的位置,当已记录从所述试样发射的荧光(15)的预给定的最大光量时,和/或,当在预给定的时间段之内还未记录从所述试样发射的荧光(15)的预给定的最小光量时,至少中断所述试样的以所述光强度分布(22)的聚焦的荧光阻抑光(19)的加载。选择所述试样的感兴趣的部分区域,其方式是,使聚焦的荧光激发光在无荧光阻抑光(19)的情况下对准所述试样,其中,记录从所述试样发射的荧光(15),其中,如果对于所述试样的一部分区域在预给定的测试时间段(Δt1)之内已记录从所述试样发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM1),则将所述试样的所述部分区域定义为感兴趣的部分区域。

High resolution imaging method and apparatus for fluorescent marking of samples

In order to carry out high resolution imaging of the structure of the sample with a fluorescent labeling, the sample is loaded with light intensity distribution. In the light intensity distribution, the intensity maximum of the focused fluorescence stimulated luminescence (14) is superimposed on the intensity minima, which is surrounded by some intensity maxima, and the intensity distribution of the focused fluorescence inhibition light (19) (22 ). Here, the interesting parts of the sample are selectively scanned with the intensity minima of the focused fluorescence inhibition light (19), in which the corresponding positions in the sample are recorded from the fluorescence emitted by the sample (15) and the minimum strength minimum of the fluorescence inhibition light (19) of the focused light (19). For the corresponding position of the intensity minimum of the focused fluorescence suppression light (19), when the pre given maximum light amount of the fluorescence (15) emitted from the sample has been recorded, and / or, at least, when the minimum amount of light pre given from the fluorescence (15) emitted from the sample is not recorded within a given time period, at least the description is interrupted. The focus of the sample is the fluorescence suppression light (19) loading with the light intensity distribution (22). The selected region of interest of the sample is selected in the manner of aligning the focused fluorescence stimulated luminescence in the case of no fluorescence inhibition light (19), in which the fluorescence emitted from the sample (15) is recorded, in which part of the region of the sample has been recorded within the pre given test time period (delta T1). Recording the predetermined minimum amount of light (LM1) of the fluorescence (15) emitted from the sample, then define the partial area of the sample as a region of interest.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于对试样的以荧光记号标记的结构高分辨率成像的方法和设备
本专利技术涉及一种用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的方法,其中,以包括聚焦的荧光激发光的强度极大值的光强度分布加载试样,其中,以光强度分布扫描试样的感兴趣的部分区域,其中,记录从试样发射的荧光并且将其与光强度分布的相应的位置相对应。此外,本专利技术涉及一种用于执行该方法的设备。本专利技术尤其涉及一种这样的用于高分辨率成像的方法,其中,用于扫描试样的感兴趣的部分区域的光强度分布除了具有聚焦的荧光激发光的强度极大值之外,具有与之叠加的、聚焦的荧光阻抑光的由一些强度极大值包围的强度极小值,从而借助于荧光阻抑光缩小试样的以下体积:所记录的荧光可以来自于该体积。尤其可以以此方式通过在激发光的波长下的所谓的衍射边界减小该体积的尺寸并且因此减小空间分辨率。荧光阻抑光可以以不同的方式阻抑用于标记试样的感兴趣的结构的荧光记号的荧光,尤其通过在STED荧光显微镜中的受激发射或者通过将荧光记号转到无荧光能力的暗状态——如例如在具有可控的荧光体的RESOLFT荧光显微镜的情况下——来阻抑。但在一些实施方式中,本专利技术也涉及用于对试样的结构进行高分辨率成像的方法,其中,不使用荧光阻抑光,也即例如共焦的激光扫描荧光显微镜。在所有根据本专利技术的方法中,由于试样的以光强度分布的加载而存在以下危险:通过光强度分布的影响来改变试样。试样的明显的改变可以在于:使用于标记待成像的结构的荧光记号漂白,即持续地使其失活。但是,荧光记号的漂白所基于的光化学过程也对试样的其他的组成部分产生影响。尤其是活着的生物试样可能由于光强度分布的影响而受损害或者完全被杀死。由于光强度分布的影响而改变试样的危险随着在光强度分布中的光强度和用于加载试样的光剂量而提高。在使用借助以激发光激发的荧光记号的受激发射起作用的荧光阻抑光的情况下,在光强度分布中的光强度必然特别高。相应地,对试样的所不期望的影响的危险也特别高。相反,STED荧光显微镜适合于,使在试样中的以荧光记号标记的结构在非常短的时间内成像,这对于变化的试样、如尤其活着的生物试样是特别感兴趣的。
技术介绍
从RAHoebe等人所著的Controlledlight-exposuremicroscopyreducesphotobleachingandphototoxicityinfluorescencelive-cellimaging(自然生物技术,第25卷,第2期,2007年2月,第249至253页)已知一种用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的方法,其中,以包括聚焦的荧光激发光的强度极大值的光强度分布加载试样,其中,以光强度分布扫描试样的感兴趣的部分区域,其中,记录从试样发射的荧光并且将其与光强度分布的相应的位置相对应,其中,当已记录从试样发射的荧光的预给定的最大光量时,或者先前当在预给定的时间段之内已经记录从试样发射的荧光的预给定的最小光量时已经中断试样的以光强度分布对于相应的位置的加载。以此方式,试样的以光强度分布的加载相对于在所有的位置上到处同样长时间的加载在以下位置上受限:在所述位置上,相对多的荧光记号或者没有荧光记号位于试样中。由此可以显著地减小为了拍摄以荧光记号标记的结构的图像而用于加载试样的光剂量。在已知的方法中,试样的以光强度分布的加载的中断通过声光调制器在来自激光器的荧光激发光的光路中的控制来进行,所述光路根据用于记录荧光的探测器的光信号来控制。R.A.Hoebe等人也描述了,可以如何校正荧光记号的仍然出现的漂白的效果的校正。为此,确定用于加载试样的像素的光剂量并且将其使用于校正所记录的荧光的强度。在图像中,Hoebe等人记录在扫描了试样的完整的体积之后在焦平面内的每个单个的像素包含的、累积的光剂量,其中,相应的光剂量以错误的色彩示出。从T.Staudt等人所著的Far-fieldopticalnanoscopywithreducednumberofstatetransitioncycles(光学快报第19卷,第6期,2011年3月14日,第5644至5657页)已知一种也称作RESCue-STED的、用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的方法。在这里,以光强度分布加载试样,在所述光强度分布中,聚焦的荧光激发光的强度极大值与聚焦的荧光阻抑光的由一些强度极大值以甜甜圈形式包围的强度极小值叠加。在此,以聚焦的荧光阻抑光的强度极小值扫描试样的感兴趣的部分,并且,记录从试样发射的荧光以及将其与聚焦的荧光阻抑光的强度极小值在试样中的相应的位置相对应。对于聚焦的荧光阻抑光的强度极小值的相应的位置,当已记录从试样发射的荧光的预给定的最大量时,或者当已经在先前在预给定的时间段之内还未记录从试样发射的荧光的预给定的最小光量时,中断试样的以由聚焦的荧光激发光和聚焦的荧光阻抑光组成的光强度分布的加载。由此,减少在拍摄试样的图像时在试样中的荧光记号经历的激发和退激(Abregung)的循环的数目并且因此减少荧光记号漂白的危险。T.Staudt等人也描述了执行RESCue策略的一种替代的方式,其中,利用关于荧光记号的位置的预先信息,以便直接地接近需要荧光阻抑所在的坐标并且忽略以下位置:在所述位置上,荧光记号可能是没有功能的。例如,提出,首先拍摄较低的分辨率的图像,以便获得关于在试样中的空间结构和特征密度的粗略信息。更确切地说,一些特征被隔离并且其他特征紧密地群集(dichtgepackt)。可以(逐渐地)应用较高的空间分辨率并且有针对性地集中在以下区域:在所述区域中应分辨紧密的特征。同时,可以忽略以下坐标:在所述坐标上,不必分离任何对象并且相应地不需要关断。关于荧光记号的或者特征的密度的预先信息可以从亮度获得。能够以两种方式实现:使改变的试样重复地成像或者沿着紧邻的平行的截面拍摄相同的试样的图像。在两种已知的方法中,由所测量的光量和试样的以强度光分布的加载的所属的持续时间的商确定在试样的相应位置上的荧光记号的浓度,因为不同于在常规的激光-扫描荧光显微镜中那样,该持续时间从位置到位置地改变,在所述常规的激光-扫描荧光显微镜中,在每个位置上加载试样相同长的时间间隔。
技术实现思路
本专利技术基于以下任务:说明用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的方法和用于执行这些方法的设备,借助所述方法和所述设备,可以在所期望的图像质量方面还进一步减小为拍摄图像而用于加载试样的光剂量。本专利技术的任务通过具有并列权利要求1、2、5、7和9的特征的方法以及根据权利要求15所述的设备解决。在从属的方法权利要求中限定根据本专利技术的方法的优选的实施方式。在用于对试样的以荧光记号标记的结构进行高分辨率成像的、根据本专利技术的第一方法中,以光强度分布加载所述试样,在所述光强度分布中,聚焦的荧光激发光的强度极大值与聚焦的荧光阻抑光的由一些强度极大值包围的强度极小值叠加。在这里,“荧光激发光”也简称“激发光”。在此,明确地,在“一些强度极大值”中使用的复数不应排除荧光阻抑光的部分光强度分布,在所述荧光阻抑光中,强度极小值被一个环状的强度极大值围绕。该光强度分布在沿着光学轴线的每个截面中示出在荧光阻抑光的强度极小值的每个侧上的分别一个强度极大值。在根据本专利技术的第一本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于对试样(2)的以荧光记号标记的结构(41)进行高分辨率成像的方法,其中,以光强度分布(22)加载所述试样(2),在所述光强度分布中,聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值(23)与聚焦的荧光阻抑光(19)的由一些强度极大值(25)包围的强度极小值(24)叠加,其中,以所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)选择性地扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38),其中,记录从所述试样(2)发射的荧光(15)以及将其与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)在所述试样(2)中的相应的位置相对应,以及其中,对于所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)的相应的位置,‑当已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时,和/或,‑当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时,至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的聚焦的荧光阻抑光(19)的加载,其特征在于,以所述聚焦的荧光激发光(14)以具有与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)的尺寸相协调的步宽的步扫描所述试样(2),其中,记录从所述试样(2)发射的荧光(15),其中,在每个步中,仅仅当在预给定的测试时间段(Δt1)之内已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM1)时,才接入所述荧光阻抑光(19)。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.23 EP 15191304.31.一种用于对试样(2)的以荧光记号标记的结构(41)进行高分辨率成像的方法,其中,以光强度分布(22)加载所述试样(2),在所述光强度分布中,聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值(23)与聚焦的荧光阻抑光(19)的由一些强度极大值(25)包围的强度极小值(24)叠加,其中,以所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)选择性地扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38),其中,记录从所述试样(2)发射的荧光(15)以及将其与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)在所述试样(2)中的相应的位置相对应,以及其中,对于所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)的相应的位置,-当已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时,和/或,-当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时,至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的聚焦的荧光阻抑光(19)的加载,其特征在于,以所述聚焦的荧光激发光(14)以具有与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)的尺寸相协调的步宽的步扫描所述试样(2),其中,记录从所述试样(2)发射的荧光(15),其中,在每个步中,仅仅当在预给定的测试时间段(Δt1)之内已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM1)时,才接入所述荧光阻抑光(19)。2.一种用于对试样(2)的以荧光记号标记的结构(41)进行高分辨率成像的方法,其中,以光强度分布(22)加载所述试样(2),在所述光强度分布中,聚焦的荧光激发光(14)的强度极大值(23)与聚焦的荧光阻抑光(19)的由一些强度极大值(25)包围的强度极小值(24)叠加,其中,以所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)选择性地扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38),其中,记录从所述试样(2)发射的荧光(15)并且将其与所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)在所述试样(2)中的相应的位置相对应,以及其中,对于所述聚焦的荧光阻抑光(19)的强度极小值(24)的相应的位置,-当已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最大光量(LM4)时,和/或,-当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时,至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的聚焦的荧光阻抑光(19)的加载,其特征在于,选择所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38),其方式是,使所述聚焦的荧光激发光(14)首先在无所述荧光阻抑光(19)的情况下直接依次地对准所述试样(2)的在扫描所述试样(2)时的扫描方向上相继而置的部分区域,其中,记录从所述试样(2)发射的荧光(15),其中,如果对于所述试样(2)的一部分区域在预给定的测试时间段(Δt1)之内已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM1),则将所述试样(2)的所述部分区域定义为感兴趣的部分区域(38),并且接着越过在所述扫描方向上相继而置的部分区域地扫描所述试样(2),其中,所述试样(2)的至少以所述光强度分布(22)的聚焦的荧光阻抑光(19)的加载仅仅在所述感兴趣的部分区域(38)中进行。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,首先仅仅以所述聚焦的荧光激发光(14)分别扫描所述试样(2)的行(35),然后,以所述聚焦的荧光激发光(14)和荧光阻抑光(19)扫描所述行(35)的以下区段:对于所述区段,在所述预给定的测试时间段(Δt1)之内已记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM1),而对于所述行(35)的所有其他的区段至少使所述荧光阻抑光(14)减弱,其中,在以所述聚焦的荧光激发光(14)和荧光阻抑光(19)扫描时,可选地,在多个横向于所述扫描方向并排而置的行(37)中对所述试样(2)的行(35)的所述区段(36)进行扫描。4.根据权利要求2和3中任一项所述的方法,其特征在于,为了选择所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38)而使用的荧光激发光相比与所述荧光阻抑光(19)叠加成所述光强度分布(22)的荧光激发光(14)具有不同的波长。5.一种尤其根据以上权利要求中任一项所述的、用于对试样(2)的以荧光记号标记的结构(41)进行高分辨率成像的方法,其中,以包括聚焦的荧光激发光的强度极大值(23)的光强度分布(22)加载所述试样(2),其中,以所述光强度分布(22)扫描所述试样(2)的感兴趣的部分区域(38),其中,记录从所述试样(2)发射的荧光(15)并且将其与所述光强度分布(22)的相应的位置相对应,以及其中,当在预给定的时间段(Δt2)之内还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的预给定的最小光量(LM2)时,至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载,其特征在于,当在至少一个预给定的、比所述时间段(Δt2)更长的另外的时间段(Δt3)之内,还未记录从所述试样(2)发射的荧光(15)的、大于所述预给定的最小光量(LM2)的另外的预给定的最小光量(LM3)时,也至少中断所述试样(2)的以所述光强度分布(22)的一部分对于所述相应的位置的加载。6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,当已经记...

【专利技术属性】
技术研发人员:A·舍恩勒C·武尔姆B·哈尔克G·唐纳特
申请(专利权)人:阿贝里奥仪器有限责任公司
类型:发明
国别省市:德国,DE

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