亲和-寡核苷酸缀合物及其用途制造技术

本文提供了使用亲和‑寡核苷酸缀合物进行单细胞表征的方法和组合物。

Affinity oligonucleotide conjugate and its use

Methods and compositions for single cell characterization using affinity oligonucleotide conjugates are provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】亲和-寡核苷酸缀合物及其用途交叉引用本申请要求于2015年9月24日提交的美国临时申请号62/232,209的优先权，该临时申请通过引用以其全文并入本文。
技术介绍
许多细胞类型可通过内源性表达的且位于其质膜上的特定组蛋白质的丰度来进行鉴定和分类。该现象使得能够利用被称为免疫表型分型的方法研究细胞，其中将细胞与对所述细胞的已知表面蛋白质具有特异性的荧光标记的抗体一起温育，并且该细胞被该荧光标记的抗体结合。流式细胞术常用于测量每种细胞的表面结合抗体的水平。然而，基于流式细胞术的方法受限于在同一实验中可同时使用的荧光团的数目。另外，在使用基于流式细胞术的方法的同一实验中可同时使用的荧光团的数目受到光谱重叠的限制。此外，流式细胞术不适于许多生物学上相关的测定和后续DNA测序。
技术实现思路
因此，存在对于在没有这些限制的情况下对单细胞进行表征，例如进行免疫表型分型的方法的需要。不同于基于流式细胞术的方法，本文所述的方法使用序列读出(readout)来分析单独细胞的蛋白质，并且不受限于同一实验中可同时使用的荧光团的数目或其光谱重叠。此外，本文所述的方法适于许多生物学上相关的测定和后续DNA测序。本文所述的方法利用亲和-寡核苷酸缀合物(例如，抗体-寡核苷酸缀合物)。所述缀合物的寡核苷酸包含条码化地加至(barcodedto)亲和-寡核苷酸缀合物的亲和部分特异性结合的表面抗原的抗原ID(AID)序列。因此，使用本文所述的方法可在不需要荧光团的情况下分析单细胞的抗原(例如，表面蛋白质)。例如，显示出的单细胞的表面蛋白质可由抗原ID序列鉴别。单细胞的一种或多种表面蛋白质可用于定义该单细胞的身份、特征或相关性。本文所述方法的亲和-寡核苷酸缀合物可用于克服以下问题：缓慢的细胞分选、与细胞分选有关的目标产量降低、有限数目的输出流以及与亲和-寡核苷酸缀合物的定量性质如亲和力不对应的选定箱元(bin)。描述的示例性亲和-寡核苷酸缀合物可代替或增强在容器中采用四聚体结合的单细胞测量进行的分选。描述的示例性亲和-寡核苷酸缀合物可在本文所述的方法中用于同时获得TCR对序列、克隆丰度和相对的四聚体亲和力。本文描述了采用亲和-寡核苷酸缀合物对容器(例如，乳液)中的细胞进行表征，例如免疫表型分型的方法。在一些实施方案中，所述方法用于以与基于乳液的单细胞分析相容的方式鉴别细胞亚群。在一些实施方案中，所述方法用于以与基于乳液的单细胞分析相容的方式鉴别对抗原具有特异性的免疫细胞。在一些实施方案中，在细胞分析之前，使表面蛋白质特异性抗体与寡核苷酸缀合。在一些实施方案中，寡核苷酸被设计为含有对于所缀合的抗体的靶特异性独特的序列基序。寡核苷酸可与亲和-寡核苷酸缀合物的亲和部分(例如，抗体)共价或非共价缀合(例如，生物素-寡核苷酸与链霉亲和素-抗体缀合)。方法可包括将细胞在具有一个或多个亲和-寡核苷酸缀合物的混合物或溶液中温育。可洗涤所述细胞以去除未结合的亲和-寡核苷酸缀合物。随后将细胞封装在容器，例如乳液中。细胞可以以每个容器单个细胞的密度存在于容器中。因此，容器例如小液滴内的亲和-寡核苷酸缀合物，例如，通过特异性抗体-表面蛋白质相互作用结合至细胞表面。所述方法可包括将容器特异性DNA序列(例如，独特的容器条码)附接至亲和-缀合的寡核苷酸。可在将亲和-缀合的寡核苷酸条码化(例如，采用DNA条码)之前、同时或之后，进行附加的细胞DNA或mRNA分析、表型测量、功能测试、细胞分选或其他的反应。方法可包括例如，在乳液实验之后从乳液提取核酸。可准备好提取的核酸以供测序并进行测序(例如，使用下一代测序技术)。方法可包括对来自含有抗原ID序列和小液滴特异性条码序列的容器的多核苷酸分子进行测序。抗原ID序列可定义由寡核苷酸缀合的抗体所结合的特异性细胞表面蛋白质。抗原ID序列可定义与特定细胞表面蛋白质结合的寡核苷酸缀合的抗体的特异性抗体。因此，抗原ID序列可指示分析的细胞所表达的表面蛋白质。在包含单细胞的容器中，含有共有小液滴特异性条码序列的所有序列都与单细胞相关联。因此，可以以显示一组表面蛋白质的方式分析单细胞，这组表面蛋白质可用于定义单细胞的身份、特征或相关性。在一个方面，提供了一种方法，其包括在多个容器中进行反应，所述反应包括将包含容器条码序列的容器条码化多核苷酸附接至与隔离在多个容器中的容器中的单细胞的靶抗原结合的亲和-寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸。在一个方面，本文提供了一种方法，其包括在多个容器中的容器中进行反应，所述反应包括将包含容器条码序列的容器条码化多核苷酸附接至亲和-寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸部分，其中所述亲和-寡核苷酸缀合物与由所述多个容器中的所述容器中的细胞表达的靶抗原结合。在一些实施方案中，所述细胞是所述容器内包含的单细胞。在一些实施方案中，所述容器包括所述多个容器中的两个或更多个容器。在一些实施方案中，所述容器包括所述多个容器中的每个容器。在一些实施方案中，所述反应在所述多个容器中的两个或更多个容器中发生。在一些实施方案中，每个容器中的细胞来自相同的样品。在一些实施方案中，所述两种或更多种多个容器中的第一多个容器中的容器中的细胞与所述两种或更多种多个容器中的第二多个容器中的容器中的细胞来自相同的样品。在一些实施方案中，所述寡核苷酸部分包含抗原标识序列(AID)。在一些实施方案中，所述AID被条码化地加至所述靶抗原或所述亲和-寡核苷酸缀合物的亲和部分。在一些实施方案中，所述寡核苷酸进一步包含条码化地加至所述靶抗原或所述亲和-寡核苷酸缀合物的亲和部分的抗原标识序列(AID)。在一些实施方案中，所述抗原标识序列(AID)是已知序列。在一些实施方案中，所述容器条码化多核苷酸来自所述容器中的模板容器条码化多核苷酸。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对所述寡核苷酸或其扩增子进行测序以获得序列信息。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所述序列信息确定所述单细胞的特征。在一些实施方案中，所述序列信息包含抗原标识(AID)序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于所述序列信息确定所述单细胞的特征。在一些实施方案中，所述特征为表型。在一些实施方案中，所述表型为免疫表型。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述亲和-寡核苷酸缀合物与包含所述单细胞的多个细胞接触。在一些实施方案中，所述接触在将所述单细胞隔离在所述容器中之前。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述接触之后洗涤所述多个细胞。在一些实施方案中，所述容器不包含不与靶抗原结合的亲和-寡核苷酸缀合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述单细胞隔离在所述容器中。在一些实施方案中，在所述隔离之前使所述单细胞与所述亲和-寡核苷酸缀合物结合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括裂解所述单细胞。在一些实施方案中，所述裂解在将所述单细胞隔离在所述容器中之后。在一些实施方案中，所述多个细胞是多个未分选的细胞。在一些实施方案中，所述多个容器中的第一容器中的容器条码化多核苷酸或其扩增子的容器条码序列不同于所述多个容器中的第二容器中的容器条码化多核苷酸或其扩增子的容器条码序列。在一些实施方案中，所述多个容器中的单个容器中的每个容器条码化多核苷酸或其扩增子的容器条码序列包含相同的容器条码序列。在一些实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种方法，其包括在多个容器中的容器中进行反应，所述反应包括将包含容器条码序列的容器条码化多核苷酸附接至亲和‑寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸部分，其中所述亲和‑寡核苷酸缀合物与由所述多个容器中的所述容器中的细胞表达的靶抗原结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.24 US 62/232,2091.一种方法，其包括在多个容器中的容器中进行反应，所述反应包括将包含容器条码序列的容器条码化多核苷酸附接至亲和-寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸部分，其中所述亲和-寡核苷酸缀合物与由所述多个容器中的所述容器中的细胞表达的靶抗原结合。2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是所述容器内包含的单细胞。3.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述多个容器中的两个或更多个容器中发生反应。4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述容器包括所述多个容器中的每个容器。5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多个容器包括两种或更多种多个容器。6.如权利要求4或5所述的方法，其中每个容器中的细胞来自相同的样品。7.如权利要求5所述的方法，其中所述两种或更多种多个容器中的第一多个容器中的容器中的细胞与所述两种或更多种多个容器中的第二多个容器中的容器中的细胞来自相同的样品。8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸部分包含抗原标识序列(AID)。9.如权利要求8所述的方法，其中所述AID被条码化地加至所述靶抗原或所述亲和-寡核苷酸缀合物的亲和部分。10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述抗原标识序列(AID)是已知序列。11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述容器条码化多核苷酸来自所述容器中的模板容器条码化多核苷酸。12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括对所述寡核苷酸或其扩增子进行测序以获得序列信息。13.如权利要求12所述的方法，其中所述方法进一步包括基于所述序列信息确定所述容器中的细胞的特征。14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述序列信息包含抗原标识(AID)序列或其互补序列并且/或者包含具有所述AID序列的分子的拷贝数。15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括基于所述序列信息确定所述单细胞的特征。16.如权利要求15所述的方法，其中所述特征为表型。17.如权利要求16所述的方法，其中所述表型为免疫表型。18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述亲和-寡核苷酸缀合物与包含所述单细胞的多个细胞接触。19.如权利要求18所述的方法，其中所述接触在将所述单细胞隔离在所述容器中之前。20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述接触之后洗涤所述多个细胞。21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述容器不包含不与靶抗原结合的亲和-寡核苷酸缀合物。22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述单细胞隔离在所述容器中。23.如权利要求22所述的方法，其中在所述隔离之前使所述单细胞与所述亲和-寡核苷酸缀合物结合。24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括裂解所述单细胞。25.如权利要求24所述的方法，其中所述裂解在将所述单细胞隔离在所述容器中之后。26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述多个细胞是多个未分选的细胞。27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述多个容器中的第一容器中的容器条码化多核苷酸或其扩增子的容器条码序列不同于所述多个容器中的第二容器中的容器条码化多核苷酸或其扩增子的容器条码序列。28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述多个容器中的单个容器中的每个容器条码化多核苷酸或其扩增子的容器条码序列包含相同的容器条码序列。29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述多个容器中的任何单个容器中的每个容器条码化多核苷酸及其扩增子的容器条码序列相对于所述多个容器中的任何其他单个容器中的每个容器条码化多核苷酸及其扩增子的容器条码序列是独特的。30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将包含容器条码的容器条码化多核苷酸附接至来自所述细胞的细胞多核苷酸。31.如权利要求30所述的方法，其中将容器条码化多核苷酸附接至亲和-寡核苷酸缀合物中的寡核苷酸和将容器条码化多核苷酸附接至来自所述单细胞的细胞多核苷酸同时进行。32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括扩增所述寡核苷酸或其互补体。33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括扩增所述细胞多核苷酸或其互补体。34.如权利要求33所述的方法，其中所述扩增所述寡核苷酸或其互补体和所述扩增所述细胞多核苷酸或其互补体同时进行。35.如权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述细胞多核苷酸的容器条码序列与所述寡核苷酸的容器条码序列相同。36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将来自所述多个容器中的两个或更多个容器的寡核苷酸或其扩增子合并。37.如权利要求36所述的方法，其中所述方法进一步包括将来自所述多个容器中的两个或更多个容器的寡核苷酸或其扩增子和细胞多核苷酸或其扩增子合并。38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述合并在测序之前。39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述亲和-寡核苷酸缀合物包含多个不同的亲和-寡核苷酸缀合物。40.如权利要求39所述的方法，其中所述多个亲和-寡核苷酸缀合物中的每个亲和-寡核苷酸缀合物包含独特的抗原标识(AID)序列。41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含条码化地加至多个亲和-寡核苷酸缀合物分子中的单个亲和-寡核苷酸缀合物分子的亲和分子条码(AMB)序列。42.如权利要求41所述的方法，其中所述多个亲和-寡核苷酸缀合物分子中的每个亲和-寡核苷酸缀合物分子包含独特的亲和分子条码(AMB)序列。43.如权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含融合序列，并且所述附接包括将所述容器条码化多核苷酸附接至该融合序列。44.如权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含引物结合序列。45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含恒定序列。46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括对所述寡核苷酸、其互补体、其扩增产物或它们的组合进行测序，从而产生寡核苷酸序列读取。47.如权利要求46所述的方法，其中所述方法进一步包括将一个或多个第一寡核苷酸序列读取与一个或多个第二寡核苷酸序列读取进行比较。48.如权利要求46或47所述的方法，其中所述方法进一步包括分析所述寡核苷酸序列读取。49.如权利要求46-48中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括分析所述寡核苷酸序列读取的容器条码序列。50.如权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括分析所述寡核苷酸序列读取的抗原标识(AID)序列。51.如权利要求46-50中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括分析所述寡核苷酸序列读取的亲和分子条码(AMB)序列。52.如权利要求48-51中任一项所述的方法，其中所述分析包括测定一个或多个容器条码序列、一个或多个AID序列、一个或多个亲和分子条码(AMB)序列或其组合的频率。53.如权利要求48-52中任一项所述的方法，其中所述分析包括比较。54.如权利要求46-53中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将寡核苷酸序列读取的抗原标识(AID)序列与寡核苷酸序列读取的亲和分子条码(AMB)序列进行比较。55.如权利要求30-54中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括对所述细胞多核苷酸、其互补体、其扩增产物或它们的组合进行测序，从而产生细胞多核苷酸序列读取。56.如权利要求55所述的方法，其中所述方法进一步包括将寡核苷酸序列读取与所述细胞多核苷酸序列读取进行比较。57.如权利要求55或56所述的方法，其中所述方法进一步包括将寡核苷酸序列读取的容器条码序列与所述细胞多核苷酸序列读取的容器条码序列进行比较。58.如权利要求55-54中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括比较所述细胞多核苷酸序列读取。59.如权利要求55-58中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括分析所述细胞多核苷酸序列读取的容器条码序列。60.如权利要求55-59中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括分析所述细胞多核苷酸序列读取的分子条码序列。61.如权利要求46-61中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括基于所述分析或所述比较来确定细胞的特征。62.如权利要求46-61中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括基于所述寡核苷酸序列读取选择抗体或TCR。63.如权利要求55-62中任一项所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗朗索瓦·维格纳尔特，阿德里安·阮格汉姆·布里格斯，斯蒂芬·J·戈德弗莱斯，布莱恩·J·贝尔蒙特，
申请(专利权)人：阿布维特罗有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US