合成DNA部件、途径和基因组的平行功能性检测制造技术

本发明专利技术涉及一种确定人工遗传元件的功能性的方法。将设计为起到与天然遗传元件相同的生物学功能的人工遗传元件引入细胞，并使所述细胞经受高频转座子诱变条件。随后，从所述细胞获得代表转座元件的插入位点的DNA序列组，并确定转座元件在天然遗传元件和人工遗传元件中的插入频率。对转座子插入频率进行比较，从而可以对所述人工功能性元件指定功能性可能性，如果转座子插入频率对于两种元件基本相等则该功能性可能性高，而如果转座子在人工遗传元件中的插入频率更高则该功能性可能性低。

Parallel functional detection of synthetic DNA components, pathways and Genomes

The invention relates to a method for determining the functionality of an artificial genetic element. It will be designed as an artificial genetic element that has the same biological function as natural genetic element, and will be used to induce the cells to be induced by high frequency transposon. Subsequently, the DNA sequence group representing the insertion site of the transposable element is obtained from the cell, and the insertion frequency of the transposing element in the natural genetic element and the artificial genetic element is determined. Comparing the insertion frequency of the transposon, it can specify the functional possibility for the functional components. If the transposon insertion frequency is basically equal to the two components, the functional possibility is high, and the possibility of the function is low if the insertion frequency of the transposon in the artificial genetic element is higher.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】合成DNA部件、途径和基因组的平行功能性检测合成生物学有希望解决有挑战性的全局性问题。对从可再生资源产生食物、燃料或化合物的途径和整个微生物细胞的生物系统设计特别受关注。近来，已成功组装了大的生物合成途径甚至全染色体的合成拷贝。尽管有这些成就，大多数的大规模合成工作维持了来自由野生型模板的基因构成和序列。然而，从头合成的实际潜力在于对缺乏生物对应体的完全重构的DNA分子的工程化。合成生物学的主要挑战在于以更有效的方式来引导设计-构建-检测循环。目前，对合成DNA分子的误差诊断和调试(debugging)仍极为困难，并且模块所包含的组分越多则越费力。已有知识受限于基因组规模的重构如何影响DNA编码的指令的功能性，这仅是因为没有可利用的探测合成基因组构建体的功能性的快速且成本有效的测试方法。DNA重构对功能性的结果往往不显著且难以预料。因为单个碱基取代可能是中性的或者完全破坏所编码的生物学功能，因此难以梳理出DNA序列中的哪些变化是可容许的而哪些则会消除所编码的遗传功能。解码DNA所编码的功能性(即，确定基因是否能够将其功能归存于细胞体系内)远比DNA测序更具挑战性。因此，对于改变序列存在犹疑，并且序列保真度相比功能保真度更被珍视。本专利技术的目的在于提供可对合成的DNA部件进行大规模平行功能性检测的手段和方法。该目的通过独立权利要求的主题来实现。本专利技术实现了将对重构生物系统的工程化提升至基因组规模，以及通过基于转座子的循环检测策略(下文也称为“Tncite”)来评估合成的基因组设计的部件功能性。通过Tncite，可以在碱基对分辨率上平行地检测各个DNA编码部件的功能性。所述方法可以用于以下任何遗传部件：i)赋予核心细胞功能的遗传部件，或ii)有条件地必需的遗传部件，或iii)对于特定生长条件或环境具有高适合度相关性的遗传部件，或iv)编码这样的生物学组分的遗传部件：诸如其终产物是必需的或能遗传偶联至阳性选择标志物的生物合成途径。Tncite部件检测方法基于三步过程(图1)。第一步：将合成包含必需的或高适合度的基因功能的DNA构建体(其尺寸至多为整个人工基因组)(合成DNA部件拷贝)引入携带着具有等同基因功能的染色体拷贝或游离基因拷贝(祖源或天然部件拷贝)的细胞中。如果合成部件和祖源部件(ancestralpart)具有相似的序列，则在设计过程中使用中性重编码或者其他碱基对取代来在合成部件中引入水印(watermark)，从而将合成序列明确区分于对应的祖源部件序列。第二步：使细胞进行高通量转座子诱变，并在选择性生长条件下培育。第三步：使用高通量测序(转座子测序)在祖源或合成部件拷贝中对Tn(转座子)插入位点作图。对于各个部件找出的转座子插入的数目给出了部件功能性的精确量度。如果合成部件具有完全功能性，则会在祖源部件拷贝和对应的合成部件拷贝两者中观察到相等的转座子插入频率(图2)。如果合成部件不具功能性，则祖源部件拷贝不含或仅含极少的干扰性转座子插入(因为祖源部件功能不会为合成部件拷贝所补偿)(图2)。本文所述的Tncite方法不依赖于待测的部件的序列和功能性的现有知识。特别是，该方法允许对未验证序列的合成DNA构建体以及由成百上千个遗传部件所组成的组合部件文库进行功能性概况分析(functionalprofiling)。这是因为，事实上除了获得部件功能性信息以外，可以直接从转座子测序数据取回并重建合成DNA构建体的序列。这使得能够对大量遗传部件文库以及编码合成途径或整个合成基因组的数千碱基长度的合成DNA构建体进行有效且高度平行化的功能性检测。综上，本专利技术广泛适用于合成生物学，以极大地加速合成基因组构建和生物合成途径工程化中的设计-工程化-检测循环。本专利技术的一个方面涉及一种确定人工遗传元件的功能性的方法，其中该方法包括以下步骤：a)提供第一批多个细胞，其中所述细胞包括其基因组内所包含的天然遗传元件；b)在转基因步骤中，在所述多个细胞内引入人工遗传元件，该人工遗传元件据预期或经设计以起到与所述天然遗传元件相同的生物学功能；c)使所述多个细胞在诱变步骤中经受高频转座子诱变条件，其中转座元件可以随机插入到所述天然遗传元件和/或所述人工遗传元件中，并在之后d)在测序步骤中获得DNA序列组，其代表来自所述多个细胞的所述转座元件的插入位点(转座子连接部)；和e)确定所述转座元件在以下两种元件中的插入频率：-所述天然遗传元件，从而获得转座子第一插入频率，和-所述人工遗传元件，从而获得转座子第二插入频率；f)比较所述天然遗传元件中的转座子第一插入频率与所述人工遗传元件中的转座子第二插入频率，并g)指定所述人工功能性元件的功能性可能性，即，-如果转座子插入频率对于两种元件基本相等，则该功能性可能性高，而-如果转座子插入在人工遗传元件中的频率更高，则该功能性可能性低。在某些实施方式中，本专利技术中所使用的细胞在引入人工遗传元件之前具有单倍体基因组。人工遗传元件的引入使得细胞成为部分二倍体(merodiploid)，或者如果在人工拷贝中添加了整个基因组的话则为二倍体。本专利技术中所使用的细胞在遗传水平上是基本无区别的。在某些实施方式中，天然遗传元件对于细胞的繁殖是必需的。借助其根本不同的序列，或者借助在将允许区分天然和人工序列的某些序列部分中有意地引入某些序列差异，可以使人工遗传元件的序列区分于天然遗传元件的序列。在诱变步骤后，使细胞增殖以便使在适合度或生活力方面的任何变化起效。在许多实施方式中，过夜培养即可。在某些实施方式中，使所述第一批多个细胞中的一份充当对照细胞或对照株(而携带人工元件的细胞被标为测试细胞或测试株)，对其在不经历所述转基因步骤的情况下进行所述诱变步骤，并获得代表来自所述对照细胞的所述转座元件的插入位点的第二组DNA序列，并确定所述转座元件在所述对照细胞的所述天然遗传元件中的第三插入频率，其中i.如果在(测试株的)所述天然遗传元件中的转座子第一插入频率比(在所述对照株的天然遗传元件中的)转座子第三插入频率更高，则将该人工功能性元件指认为具功能性的可能性高；和/或ii.如果在(测试株的)所述天然遗传元件中的转座子第一插入频率与(在所述对照株的天然遗传元件中的)转座子第三插入频率基本相等，则将该人工功能性元件指认为不具功能性的可能性高。在某些实施方式中，通过对转座子连接序列(junctionsequence)进行分离、鉴定或测序来获得所述DNA序列组。转座子连接序列包括所述转座元件的至少一部分和其中插入有所述转座元件的天然遗传元件或人工元件的至少一部分。其可以通过PCR分离、鉴定或测序。方法包括现有技术中已知的目前用于DNA序列的鉴定、测序或分离的PCR规程，该方法使用：-能够与所述转座元件所包含的序列特异性退火的第一引物和能够与所述天然遗传元件所包含的序列退火的第二引物，或-所述第一引物、能够与所述天然遗传元件的至少一部分中所包含的序列退火的第二引物、以及能够同时与所述人工遗传元件所包含的序列和所述天然遗传元件所包含的序列退火的第三引物，或-能够与所述人工遗传元件所包含的序列和所述天然遗传元件所包含的序列退火的第三引物。本领域技术人员理解，扩增物(amplificate)必须能通过其序列区分，即序列引物必本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定人工遗传元件的功能性的方法，其中该方法包括以下步骤：a)提供第一批多个细胞，其中所述细胞包括对于所述细胞的繁殖所必需的天然遗传元件；b)在转基因步骤中，在所述多个细胞内引入人工遗传元件，该人工遗传元件据预期或经设计以起到与所述天然遗传元件相同的生物学功能；c)使所述多个细胞在诱变步骤中经受高频转座子诱变条件，其中转座元件可以插入到所述天然遗传元件和/或所述人工遗传元件中，并在之后d)获得DNA序列组，其中每个序列代表来自所述多个细胞的所述转座元件的插入位点；和e)确定所述转座元件在以下两种元件中的插入频率：‑所述天然遗传元件，和‑所述人工遗传元件，f)比较所述天然遗传元件中的转座子插入频率与所述人工遗传元件中的转座子插入频率，并g)指定所述人工功能性元件的功能性可能性，即，‑如果转座子插入频率对于两种元件基本相等，则该功能性可能性高，而‑如果转座子插入在人工遗传元件中的频率更高，则该功能性可能性低。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.19 EP 15195390.81.一种确定人工遗传元件的功能性的方法，其中该方法包括以下步骤：a)提供第一批多个细胞，其中所述细胞包括对于所述细胞的繁殖所必需的天然遗传元件；b)在转基因步骤中，在所述多个细胞内引入人工遗传元件，该人工遗传元件据预期或经设计以起到与所述天然遗传元件相同的生物学功能；c)使所述多个细胞在诱变步骤中经受高频转座子诱变条件，其中转座元件可以插入到所述天然遗传元件和/或所述人工遗传元件中，并在之后d)获得DNA序列组，其中每个序列代表来自所述多个细胞的所述转座元件的插入位点；和e)确定所述转座元件在以下两种元件中的插入频率：-所述天然遗传元件，和-所述人工遗传元件，f)比较所述天然遗传元件中的转座子插入频率与所述人工遗传元件中的转座子插入频率，并g)指定所述人工功能性元件的功能性可能性，即，-如果转座子插入频率对于两种元件基本相等，则该功能性可能性高，而-如果转座子插入在人工遗传元件中的频率更高，则该功能性可能性低。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一批多个细胞中的一份充当对照细胞，使其在不经历所述转基因步骤的情况下进行所述诱变步骤，并获得代表来自所述对照细胞的所述转座元件的插入位点的第二DNA序列组，并确定所述转座元件在所述对照细胞的所述天然遗传元件中的第三插入频率，其中i.如果转座子第一插入频率比转座子第三插入频率更高，则将所述人工功能性元件指认为具功能性的可能性高；和/或ii.如果转座子第一插入频率与转座子第三插入频率基本相等，则将所述人工功能性元件指认为不具功能性的可能性高。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过PCR分离包含所述转座元件的至少一部分和所述天...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·克里斯滕，M·克里斯滕，
申请(专利权)人：苏黎世联邦理工学院，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH