稳定特定RNA的通用方法技术

技术编号:18464326 阅读:32 留言:0更新日期:2018-07-18 15:09
本发明专利技术涉及用于通过将一种或多种保护性/稳定性寡核苷酸杂交至RNA分子来稳定特定RNA分子的方法和组合物,所述特定RNA分子可以是检测目标或对照标准品。

A general method for stabilizing a specific RNA

The present invention relates to a method and composition for stabilizing a specific RNA molecule by crossing one or more protective / stable oligonucleotides to a RNA molecule, the specific RNA molecule may be a detection target or a control standard.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定特定RNA的通用方法专利
本专利技术属于体外诊断学领域,且具体属于经扩增技术检测和定量核酸的领域。专利技术背景在分子诊断学领域中,从众多来源扩增核酸具有相当重要的意义。核酸扩增和检测的诊断学应用实例是检测病毒诸如人乳头瘤病毒(HPV)、西尼罗河病毒(WNV)或常规筛查献血者中人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)和/或丙型肝炎病毒(HCV)的存在。此外,所述扩增技术适用于细菌目标如分枝杆菌,或肿瘤标志物的分析。最突出和最广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其他扩增反应尤其包括连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、Gap-LCR、修复链反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Qβ扩增。用于基于PCR分析的自动化系统通常利用在同一反应容器中的PCR过程中实时检测产物扩增。这种方法的关键是使用带有报道基团或标记的修饰的寡核苷酸。在临床核酸诊断领域中最期望的或者甚至是强制性的是使用具有已知序列的对照核酸来控制相应的扩增,以用于定性(性能控制)和/或定量(使用对照作为参考测定靶核酸的量)目的。考虑到特别是诊断靶标包括原核、真核以及病毒核酸的多样性,并且鉴于不同类型的核酸如RNA和DNA之间的多样性,对照核酸通常以特定方式设计。简言之,这些对照通常类似于它们作为对照的靶核酸,以便在该过程中模拟它们的性质。这种情况适用于定性和定量测定。在单个或平行实验中要检测多个参数的情况下,通常使用类似于不同靶核酸的不同对照,诸如,例如在Swanson等人(J.Clin.Microbiol.,2004,42,第1863-1868页)。Stöcher等人(J.Virol.Meth.,2003,108,第1-8页)公开了其中多种病毒特异性竞争对照包含在同一DNA分子上的对照核酸。在过去的几年中,基于特定核酸序列的检测,已开发了针对特定mRNA种类的诊断测定和测定法。许多这些测定已经适用于确定特定RNA种类的绝对浓度。这些绝对定量测定需要使用之前已经确定了精确量的RNA标准品。这些RNA标准品通常通过体外转录来合成,或者是致病因子本身。纯化RNA,然后通过几种不同方法定量,如OD260处的吸光度、磷酸盐分析、增色或同位素示踪分析(Collins,1995)。由于RNA固有的热不稳定性和无处不在的RNA酶污染源,用作标准品的特定目标mRNA和RNA在样品采集、储存或其他下游过程中经常经受不希望的降解,常常导致测试失败或检测灵敏度降低。一种常用的稳定RNA的方法是所谓的“装甲RNA(armoredRNA)”方法,其中使用噬菌体的外壳蛋白包封RNA以产生假病毒颗粒(并且如在US5,677,124和U.S.5,939,262中进一步描述的那样)。RNA包封的另一种方法涉及AccuPlex技术(SeraCareLifeSciences,MilfordMA),其中目标RNA由哺乳动物病毒包膜内的胞吐作用产生。然而,由这些包封颗粒提供的RNA保护在高温下受到限制。显然,需要新的方法和组合物,其增加在冷藏可能受限的区域中开发的产品中的RNA的保质期。专利技术概述本专利技术涉及用于稳定特定RNA分子的方法和组合物,所述特定RNA分子可以是检测目标或对照标准品。在一个方面,本专利技术涉及防止或降低在扩增反应中扩增的单链RNA模板的区段的降解的方法,所述方法包括以下步骤:提供单链RNA模板;将单链RNA模板与一种或多种寡核苷酸杂交,所述寡核苷酸的序列与扩增的单链RNA模板的区段完全或部分互补;和在反应条件下逆转录并扩增所述单链RNA模板的区段:其中所述一种或多种寡核苷酸不干扰逆转录和扩增。由此,一种或多种寡核苷酸在逆转录和扩增期间不用作引物、探针或模板。在一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸具有比扩增期间使用的延伸温度低至少5℃的解链温度。在另一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸的解链温度比逆转录和扩增期间使用的引物和探针的解链温度低至少5℃。在一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸以比逆转录和扩增期间使用的引物和探针的浓度低至少50倍的浓度存在。在另一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸以0.1nM至2.0nM的浓度存在。在一个实施方案中,所述一种或多种寡核苷酸与扩增的单链RNA模板超过48%的区段杂交。在一个实施方案中,所述一种或多种寡核苷酸与扩增的单链RNA模板超过60%、超过75%或超过90%的区段杂交。在一个实施方案中,所述一种或多种寡核苷酸与扩增的单链RNA模板的完整区段杂交。在一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸的长度为11个核苷酸至50个核苷酸或11个核苷酸至40个核苷酸或长度为11个核苷酸至30个核苷酸。在某些实施方案中,多个寡核苷酸与单链RNA分子超过90%的区段杂交,其中来自多个寡核苷酸的每一种寡核苷酸的长度为11至30个核苷酸。在另一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸具有范围为20℃至80℃、或30℃至70℃、或40℃至70℃、或40℃至60℃的解链温度。在又另一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸的序列不与来自一种或多种寡核苷酸的另一个寡核苷酸的序列重叠。在另一个实施方案中,单链RNA模板被笼蔽(caged)。可以通过包封、包壳、捕获或通过RNA模板在细胞内来完成笼蔽。在另一个实施方案中,分离或纯化单链RNA模板的步骤在逆转录和扩增步骤之前进行。在另一个实施方案中,一种或多种寡核苷酸包含一组寡核苷酸,其序列选自SEQIDNO:1-10、11-19、20-27和28-35。在另一方面,本专利技术涉及在扩增反应期间检测样品中测试的RNA序列的存在的方法,其包括获得样品;获得用作检测和/或定量测试的RNA序列中的标准品的核酸标准品,其中所述核酸标准品包含单链RNA对照序列和一种或多种寡核苷酸,所述寡核苷酸的序列与单链RNA对照序列的区段完全或部分互补;混合样品和核酸标准品;提供进行测试的RNA序列和单链RNA对照序列区段的逆转录和扩增的条件,其中在这些条件下,所述一种或多种寡核苷酸不干扰逆转录和扩增;和检测来自测试的RNA序列和来自单链RNA对照序列的扩增产物。由此,一种或多种寡核苷酸在逆转录和扩增期间不用作引物、探针或模板。在一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸具有比扩增期间使用的延伸温度低至少5℃的解链温度。在另一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸的解链温度比逆转录和扩增期间使用的引物和探针的解链温度低至少5℃。在一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸以比逆转录和扩增期间使用的引物和探针的浓度低至少50倍的浓度存在。在另一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷酸的每一种寡核苷酸以0.1nM至2.0nM的浓度存在。在一个实施方案中,所述一种或多种寡核苷酸与单链RNA对照序列超过48%的区段杂交。在一个实施方案中,所述一种或多种寡核苷酸与扩增的单链RNA对照序列超过60%、超过75%或超过90%的区段杂交。在一个实施方案中,所述一种或多种寡核苷酸与单链RNA对照序列的完整区段杂交。在一个实施方案中,来自一种或多种寡核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.防止或降低在扩增反应中扩增的单链RNA模板的区段的降解的方法,所述方法包括以下步骤:a) 提供单链RNA模板;b) 将所述单链RNA模板的区段与一种或多种寡核苷酸杂交,所述寡核苷酸的序列与被扩增的单链RNA模板的区段完全或部分互补;和c) 在这样的反应条件下逆转录和扩增所述单链RNA模板的区段:其中所述一种或多种寡核苷酸不干扰逆转录和扩增,并且其中来自所述一种或多种寡核苷酸的每一寡核苷酸特征在于具有比扩增过程中使用的延伸温度低至少5℃的解链温度和以比逆转录和扩增过程中使用的引物和探针的浓度低至少50倍的浓度存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.28 US 62/2716141.防止或降低在扩增反应中扩增的单链RNA模板的区段的降解的方法,所述方法包括以下步骤:a)提供单链RNA模板;b)将所述单链RNA模板的区段与一种或多种寡核苷酸杂交,所述寡核苷酸的序列与被扩增的单链RNA模板的区段完全或部分互补;和c)在这样的反应条件下逆转录和扩增所述单链RNA模板的区段:其中所述一种或多种寡核苷酸不干扰逆转录和扩增,并且其中来自所述一种或多种寡核苷酸的每一寡核苷酸特征在于具有比扩增过程中使用的延伸温度低至少5℃的解链温度和以比逆转录和扩增过程中使用的引物和探针的浓度低至少50倍的浓度存在。2.权利要求1的方法,其中所述一种或多种寡核苷酸与被扩增的单链RNA模板超过48%的区段杂交。3.权利要求2的方法,其中所述一种或多种寡核苷酸与被扩增的单链RNA模板的完整区段杂交。4.权利要求1-3中任一项的方法,其中来自所述一种或多种寡核苷酸的每一寡核苷酸长度为11个核苷酸至50个核苷酸。5.权利要求1-4中任一项的方法,其中所述单链RNA模板被笼蔽。6.权利要求5的方法,其中将单链RNA模板通过选自包封、包壳、捕获和在细胞内的方式笼蔽。7.权利要求1-6中任一项的方法,其在步骤b)和步骤c)之间进一步包括分离或纯化单链RNA模板的步骤。8.权利要求1-7中任一项的方法,其中所述一种或多种寡核苷酸包含一组寡核苷酸,其序列选自SEQIDNO:1-10、11-19、20-27和28-35。9.在扩增反应过程中检测样品中测试的RNA序列的存在的方法,其包括:a)提供样品;b)提供用作测试的RNA序列的检测和/或定量中的标准品的核酸标准品,其中所述核酸标准品包含单链RNA对照序列和一种或多种寡核苷酸,所述寡核苷酸的序列与单链RNA对照序列的区段完全或部分互补;c)将所述样品和所述核酸标准品混合;d)提供用于进行逆转录和扩增所述测试的RNA序列和单链RNA对照序列的区段两者的条件,其中在所述条件下,所述一种或多种寡核苷酸不干扰逆转录和扩增并且其中来自所述一种或多种寡核苷酸的每一寡核苷酸特征在于具有比扩增过程中使用的延伸温度低至少5℃的解链温度和以比逆转录和扩增过程中使用的引物和探针的浓度低至少50倍的浓度存在;和e)检测来自所述测试的RNA序列和来...

【专利技术属性】
技术研发人员:A古普塔
申请(专利权)人:豪夫迈·罗氏有限公司
类型:发明
国别省市:瑞士,CH

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