使用高浓度糖混合物诱导基因表达制造技术

技术编号:18464314 阅读:42 留言:0更新日期:2018-07-18 15:09
本文描述了可用于对在诱导型启动子序列控制下表达的基因进行诱导表达的组合物,以及用于制备和使用所述组合物的方法。

Using high concentration sugar mixture to induce gene expression

This article describes a composition that can be used to induce expression of genes expressed under the control of an inducible promoter sequence, and a method for the preparation and use of the composition.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用高浓度糖混合物诱导基因表达相关申请的交叉引用本申请要求于2015年7月7日提交的美国临时专利申请序列号62/189,462的优先权,将其以全文通过引用特此结合。
本专利技术涉及用于改进从细胞培养物产生蛋白质的方法。本专利技术还涉及增加由在诱导型基因启动子控制下的基因产生的蛋白质的量的培养组分和条件。所述改进的方法可以用于产生由天然存在的纤维素酶基因以及从各种异源构建体编码的蛋白质。
技术介绍
丝状真菌和纤维素分解菌产生细胞外纤维素酶,所述细胞外纤维素酶赋予生物体水解纤维素的β-(1,4)-连接的糖苷键以产生葡萄糖的能力。这些酶为生物体提供了使用纤维素(最丰富的植物多糖)用于生长的能力。丝状真菌里氏木霉(Trichodermareesei)(里氏木霉(T.reesei);真菌红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的无性型)是纤维素酶的有效生产者。因此,针对里氏木霉产生这些酶的能力已经对其进行了开发利用,这些酶在这样的商品如燃料乙醇、衣物、洗涤剂、纤维和其他产品的生产中是有价值的。木霉属中的主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、egl1和egl2的表达和产生取决于可用于生长的碳源。纤维素酶基因被葡萄糖严格抑制,而被纤维素或二糖(例如,槐糖、乳糖或龙胆二糖)诱导数千倍。公开的美国专利7713725披露了将全纤维素酶制剂添加到浓葡萄糖溶液中并进行充分的孵育,所得复合混合物能够不经进一步纯化而诱导纤维素酶产生。蔗糖,通常被称为食用糖或糖,由甘蔗和甜菜制成。包括蔗糖糖蜜(制糖工业的重要残余物)的蔗糖来源可在世界一些地方,例如巴西、印度、欧盟、中国、泰国和美国大量得到。在蔗糖来源丰富且便宜的这些地方,尤其在需要大量或大体积的这种糖源来生产用于大型商业规模运营的诱导物的情况下,葡萄糖的成本可以被认为相对非常昂贵。因此,存在对包含蔗糖的方便的可溶性底物组合物的需要,所述组合物还提供了在丝状真菌(例如里氏木霉)中纤维素酶诱导的便宜方法,用于位于蔗糖是最丰富并且是成本效益的糖源的地区的商业运营。
技术实现思路
本专利技术涉及用于改进从细胞培养物产生蛋白质的方法。本专利技术还涉及增加由在诱导型基因启动子控制下的基因产生的蛋白质的量的培养组分和条件。所述改进的方法可以用于产生由天然存在的纤维素酶基因以及从各种异源构建体编码的蛋白质。在第一方面,本公开提供了一种产生诱导性饲料组合物的方法,所述方法包括以下步骤:(a)生成第一混合物,所述第一混合物包含含有蔗糖和至少一种转化性酶的第一溶液;并且(b)将所述第一混合物在一定温度处孵育足够的时间以产生转化的混合物;并且(c)产生第二混合物,所述第二混合物包含由(b)产生的转化的混合物和至少一种逆转性酶(revertingenzyme);并且(d)将所述第二混合物在一定温度处孵育足够的时间以产生所述诱导性饲料组合物。在某些实施例中,第一溶液包含甘蔗汁糖浆(SJS)。在某些其他实施例中,第一溶液包含非常高纯度蔗糖(VHP)。在一些实施例中,第一溶液包含糖蜜(Mol)。在某些另外的实施例中,该方面的转化性酶(invertingenzyme)是转化酶(invertase)。在以上实施例的任一项中,将第一混合物在从约30℃至约100℃范围内的温度处孵育持续1小时与60小时之间的时间段。例如,第一混合物可以在从约50℃至约80℃的温度处孵育持续2小时与30小时之间。在第一方面所述的方法的以上实施例的任一项中,转化性酶可以是包含β-葡糖苷酶的全纤维素酶组合物。例如,逆转性酶可以是富含β-葡糖苷酶的纤维素酶组合物。在又另外的实施例中,将该方面所述的方法的第二混合物在落入从约30℃至约100℃范围内的温度处孵育持续2小时与72小时之间的时间段。例如,第二混合物可以在从约30℃至约90℃(例如像约40℃至约90℃、约40℃至约80℃、约50℃至约80℃等)范围内的温度处孵育持续2小时至65小时之间(例如像2小时与60小时之间、5小时与55小时之间、10小时与50小时之间等)的时间段。在第二方面,本公开提供了通过应用以上第一方面的实施例的任一项所述的方法产生的诱导性饲料组合物。在一些实施例中,诱导性饲料组合物包含糖的混合物。在某些实施例中,诱导性饲料组合物进一步包含槐糖。在某些另外的实施例中,诱导性饲料组合物可以包含龙胆二糖。在第三方面,本公开提供了一种用于从细胞培养物产生目的蛋白质的方法,所述方法包括以下步骤:首先,按照以下步骤产生诱导性饲料组合物:(i)孵育包含从约50%至约70%蔗糖和至少一种转化性酶的溶液,产生第一混合物;并且(ii),将所述第一混合物在合适的温度处孵育足够的时间段以产生转化的混合物;(iii)通过将由(ii)产生的转化性混合物与至少一种逆转性酶进行组合来产生第二混合物;并且(iv)将第二混合物在合适的温度处孵育足够的时间段以产生诱导性饲料组合物;并且其次,使细胞培养物与通过以上步骤产生的诱导性饲料组合物以有效诱导通过细胞培养表达目的蛋白质的量进行接触,该细胞培养物包含编码目的蛋白质的核苷酸序列的细胞,该核苷酸序列有效地连接至诱导型启动子。在该方面所述方法的一些实施例中,将第一混合物在从约30℃至约100℃范围的温度处孵育持续1小时与60小时之间的时间段。例如,第一混合物可以在从约30℃至约90℃(例如像约30℃至约80℃、约40℃至约90℃、约40℃至约80℃、约50℃至约80℃等)范围的温度处孵育持续2小时与60小时之间(例如像2小时与55小时之间、5小时与60小时之间、10小时与50小时之间等)的时间段。在该方面所述的方法的一些实施例中,将第二混合物在从约30℃至约100℃范围的温度处孵育持续2小时与72小时之间的时间段。例如,可以将第二混合物在落入从约30℃至约90℃(例如像约30℃至约80℃、约40℃至约90℃、约40℃至约80℃、约40℃至约70℃、约50℃至约80℃等)范围内的温度处孵育持续2小时与70小时之间(例如像5小时与65小时之间、10小时与60小时之间、12小时与55小时之间等)的时间段。在该方面所述的方法的某些实施例中,目的蛋白质是内源性蛋白质。在某些另外的实施例中,目的蛋白质是异源蛋白质。在一些实施例中,目的蛋白质选自下组,该组由以下各项组成:酶、激素、生长因子、细胞因子和抗体。例如,目的蛋白质可以是以下项之一:半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶及其混合物。在一些实施例中,诱导型启动子是槐糖诱导型启动子。在一些实施例中,诱导型启动子是龙胆二糖诱导型启动子。在一些实施例中,该启动子是纤维素酶基因启动子。例如,该启动子可以是来自里氏木霉的cbh1启动子。在一些实施例中,所述细胞培养物的细胞是丝状真菌细胞。例如,该丝状真菌细胞是选自下组的细胞,该组由以下各项组成:木霉属、腐质霉属、镰孢菌属、曲霉属、脉孢菌属、青霉属、头孢霉属、绵霉属(Achlya)、柄孢壳菌属(Podospora)、内座壳属、毛霉属、旋孢腔菌属、毁丝霉属(Myceli本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.一种产生诱导性饲料组合物的方法,所述方法包括以下步骤:a)通过将含蔗糖溶液与至少一种转化性酶混合来生成第一混合物;b)将所述第一混合物在第一温度处孵育第一时间段以产生转化的混合物;c)通过将由b)产生的转化的混合物与至少一种逆转性酶混合来生成第二混合物;并且d)将所述第二混合物在第二温度处孵育第二时间段以产生所述诱导性饲料组合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.07 US 62/189,4621.一种产生诱导性饲料组合物的方法,所述方法包括以下步骤:a)通过将含蔗糖溶液与至少一种转化性酶混合来生成第一混合物;b)将所述第一混合物在第一温度处孵育第一时间段以产生转化的混合物;c)通过将由b)产生的转化的混合物与至少一种逆转性酶混合来生成第二混合物;并且d)将所述第二混合物在第二温度处孵育第二时间段以产生所述诱导性饲料组合物。2.权利要求1所述的方法,其中所述含蔗糖溶液包含甘蔗汁糖浆(SJS)。3.权利要求1所述的方法,其中所述含蔗糖溶液包含极高纯度蔗糖(VHP)。4.权利要求1所述的方法,其中所述含蔗糖溶液包含糖蜜(Mol)。5.权利要求1所述的方法,其中所述转化性酶是转化酶。6.权利要求1所述的方法,其中所述第一温度在从约30℃至约100℃的范围内,并且所述第一时间段在1小时与60小时之间。7.权利要求1所述的方法,其中所述逆转性酶是包含β-葡糖苷酶的全纤维素酶组合物。8.权利要求7所述的方法,其中所述逆转性酶是富含β-葡糖苷酶的纤维素酶组合物。9.权利要求1所述的方法,其中所述第二温度在从约30℃至约100℃的范围内,并且所述第二时间段在2小时与72小时之间。10.一种通过应用权利要求1所述的方法产生的诱导性饲料组合物。11.权利要求10所述的诱导性饲料组合物,所述诱导性饲料组合物包含糖的混合物。12.权利要求11所述的诱导性饲料组合物,所述诱导性饲料组合物包含槐糖。13.一种用于从细胞培养物产生目的蛋白质的方法,所述方法包括以下步骤:(a)产生诱导性饲料组合物,其包括以下步骤:(i)通过将包含从约50%至约70%蔗糖的溶液与至少一种转化性酶混合来生成第一混合物;(ii)将所述第一混合物在第一温度处孵育第一时间段以产生转化的混合物;并且(iii)通过将由(ii)产生的转化性混合物与至少一种逆转性酶混合来生成...

【专利技术属性】
技术研发人员:T·C·道奇I·I·克鲁斯C·米奇森T·T·维尔亚瓦
申请(专利权)人:丹尼斯科美国公司
类型:发明
国别省市:美国,US

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1