通过应用重组酵母用于生产邻氨基苯甲酸和/或苯胺的方法技术

本发明专利技术涉及应用酵母细胞从可发酵底物生产邻氨基苯甲酸。

Method for producing o aminophenoic acid and / or aniline by using recombinant yeast

The invention relates to the production of aminobenzoic acid from a fermentable substrate using yeast cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过应用重组酵母用于生产邻氨基苯甲酸和/或苯胺的方法本专利技术涉及应用酵母细胞从可发酵底物生产邻氨基苯甲酸。目前，没有可商购的邻氨基苯甲酸酯或相应的酸的可再生的或生物学衍生的来源。邻氨基苯甲酸酯是莽草酸(shikimateacid)途径的天然中间体和用于芳香族氨基酸L-色氨酸的生物合成的前体。WO2015/124687中已描述了邻氨基苯甲酸酯向苯胺的化学转化。目前的苯胺的生产方法依赖于从石油衍生原料化学合成。与为可再生的原料诸如可再生的资源“生物质”相反，这些石油衍生原料不是可再生的。苯胺的化学合成是多步骤工艺。在苯胺的生产中牵涉的几个反应步骤导致高生产成本。而且，苯胺的常规的、也即化学的合成与可对环境具有实质性影响的有危害的中间体、溶剂和废品相关。芳香环上的非特异性副反应导致产物收率的减少，因而进一步增加生产成本。石油衍生原料受到全球石油价格引起的成本波动的影响。WO2015/124687公开了生产生物学衍生的邻氨基苯甲酸酯和苯胺的概念。应用两个转化步骤：(1)邻氨基苯甲酸酯的发酵生产，和(2)邻氨基苯甲酸向苯胺的随后的催化转化。总体工艺概念包括下列加工步骤：a)通过应用重组细菌宿主细胞发酵包含至少一种可发酵碳底物的原料来生产邻氨基苯甲酸酯，所述重组细菌宿主细胞能够将包含至少一种可发酵碳底物的所述原料生物学地转化成邻氨基苯甲酸酯，其中所述邻氨基苯甲酸酯包含氨茴酸根阴离子，(随后是细胞去除)，b)通过酸质子化将所述邻氨基苯甲酸酯从无细胞含水发酵肉汤中的所述氨茴酸根阴离子转化成氨茴酸，c)通过沉淀或通过在有机溶剂中溶解来回收所述氨茴酸，和d)通过在有机溶剂中热脱羧将所述氨茴酸转化成苯胺。所述工艺中应用的重组细菌属于棒状杆菌属(Corynebacterium)或假单胞菌属(Pseudomonas)的家族。这两种细菌都在pH7、在有氧条件下、并且一般在指数期期间生产邻氨基苯甲酸酯。于WO2015/124687中描述的细菌的这些特征导致几个问题：(i)由于邻氨基苯甲酸酯在pH7的发酵生产(步骤a)，需要加入碱例如NaOH以便确保稳定的中性pH。在随后的步骤b)中，需要加入酸例如HCl以便将邻氨基苯甲酸酯转化成邻氨基苯甲酸。因此，作为副产物，形成了例如NaCl。NaOH、HCl的应用以及得到的NaCl盐溶液的废水处理导致通过现有技术中描述的生物技术工艺生产的邻氨基苯甲酸的增加的生产成本。(ii)而且，邻氨基苯甲酸酯对微生物细胞有毒性。如果微生物细胞显示对邻氨基苯甲酸酯增加的抗性，引起所述抗性的许多机理需要能量消耗。因而，一定比例的可发酵底物被消耗用于维持代谢，导致邻氨基苯甲酸酯的降低的收率。由于这一原因，该工艺的合理的时空收率所需的高滴度的邻氨基苯甲酸酯伴随地降低产物收率。(iii)由于发酵在有氧条件下运行，发酵容器需要充气和搅拌，两者都导致对发酵单元的增加的投资和操作成本。(iv)而且，邻氨基苯甲酸酯一般在指数期期间生产并与微生物生长偶联。这一事实进一步降低邻氨基苯甲酸酯生产的总体收率。尽管从可再生的来源生物技术生产邻氨基苯甲酸酯作为用于苯胺生产的前体提供潜在益处，如果发酵中应用细菌，所有上述因素都减少这一工艺的潜在益处。因此，对于用于从可再生的来源生产邻氨基苯甲酸酯和苯胺的替代方法存在需求。这一问题通过权利要求书和说明书中限定的实施方案得以解决。在第一实施方案中，本专利技术涉及用于生产邻氨基苯甲酸的方法，包括下列步骤：a)应用能够将至少一种可发酵底物转化成邻氨基苯甲酸的酵母细胞将发酵容器中的至少一种可发酵底物发酵；和b)将生产的邻氨基苯甲酸与发酵肉汤分离。能够将可发酵底物转化成邻氨基苯甲酸的酵母细胞能够将可发酵底物转化成邻氨基苯甲酸的酵母细胞是这样的酵母细胞，其将可发酵底物的至少一部分转化成邻氨基苯甲酸和将生产的邻氨基苯甲酸的至少一部分释放到发酵肉汤中。由于邻氨基苯甲酸是导致芳香族氨基酸色氨酸的生产的生物化学途径中的中间体，野生型酵母细胞通常不释放邻氨基苯甲酸。因此，能够将至少一种可发酵底物转化成邻氨基苯甲酸的酵母细胞优选地是这样的酵母细胞，其生物化学途径以这样的方式被修饰，即并非所有生产的邻氨基苯甲酸在进一步的生物化学反应中被利用而是在细胞中积累和最终被释放到发酵肉汤中。原则上，有两个途径获得这样的细胞。(i)可以增加通过导致邻氨基苯甲酸的途径的碳通量，以致邻氨基苯甲酸的生产率超过导致色氨酸合成的下游反应引起的消耗率。(ii)可以降低将邻氨基苯甲酸转化成随后的代谢物或产物例如色氨酸的途径的容量(capacity)，以致即使野生型菌株中发现的邻氨基苯甲酸的生产率也引起这一化合物的积累。在本专利技术的一个优选的实施方案中，消耗邻氨基苯甲酸的至少一个生物化学途径被完全封闭。如果组合两个途径以致酵母细胞与野生型细胞相比具有增加的邻氨基苯甲酸的生产率和同时降低的邻氨基苯甲酸的消耗，则获得特别有利的结果。用于获得具有上述特性的酵母细胞的方法是本领域公知的。通过筛选将邻氨基苯甲酸释放到培养基中的突变体可简单地选择合适的细胞。通过普通手段诸如电离辐射或化学诱变剂可增加这一实验中的突变体的频率。但是，由于这一工艺取决于机遇，通过遗传工程靶向相关途径的关键酶是更优选的。应用遗传工程的普通方法，可随意增加、降低或甚至废除基因的表达和酶活性。要在本专利技术方法中应用的优选的酵母物种是棉桃阿舒氏囊霉(Ashbyagossypii)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、多形汉逊氏酵母(Hansenulapolymorpha)、耶氏解脂酵母(Yarrowialipolytica)、拜列氏接合糖酵母(Zygosaccharomycesbailii)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。更优选地，酵母是酿酒酵母。优选地，能够将可发酵底物转化成邻氨基苯甲酸的酵母细胞包含邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶(anthranilatephosphoribosyltransferase)活性的修饰，所述修饰降低所述酶活性。通过这一修饰，降低或完全废除从邻氨基苯甲酸酯到N-(5-磷酸-D-核糖基)-氨茴酸酯的通量。因此，所述修饰导致邻氨基苯甲酸酯的积累。术语邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶活性指催化邻氨基苯甲酸酯向N-(5-磷酸-D-核糖基)-氨茴酸酯转化的酶活性。在酵母中，邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶活性由Trp4(YDR354W)介导。邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶活性的上述降低可以通过三个原理方式实现：(i)可以对酵母中trp4基因的表达的调节进行修饰，以致降低或废除基因的转录。(ii)可以对trp4基因的核酸序列进行修饰，以致修饰的基因所编码的酶具有较低的比活性。(iii)可以将trp4基因替换为来自不同于酵母的生物并编码具有比Trp4低的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶比活性的酶的基因。在本专利技术的一个特别优选的实施方案中，酵母细胞没有残余的邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶活性。优选地，这通过废除酵母细胞中trp4基因的表达或通过以产生没有邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶活性的蛋白这样的方式修饰trp4基因的核酸序列而实现。这样的修饰所产生的菌株在本领域中也称为“敲除菌株”。显然地，这样的菌株是对于L-色氨酸营养缺陷型的。邻氨基苯甲酸如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于生产邻氨基苯甲酸的方法，其包括下列步骤：a) 用能够将至少一种可发酵底物转化成邻氨基苯甲酸的酵母细胞将发酵容器中的所述至少一种可发酵底物发酵；和b) 将生产的邻氨基苯甲酸与发酵肉汤分离。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.18 EP 15201326.4;2016.02.29 EP 16157777.01.用于生产邻氨基苯甲酸的方法，其包括下列步骤：a)用能够将至少一种可发酵底物转化成邻氨基苯甲酸的酵母细胞将发酵容器中的所述至少一种可发酵底物发酵；和b)将生产的邻氨基苯甲酸与发酵肉汤分离。2.根据权利要求1的方法，其中在降低所述发酵肉汤的pH之后实施在方法步骤b)中邻氨基苯甲酸的所述分离。3.根据权利要求1或2的方法，其中通过调节所述发酵容器中搅拌器的旋转速度实施在方法步骤b)中所述生产的固体邻氨基苯甲酸的所述分离。4.根据权利要求1或2的方法，其中通过过滤、沉降、旋液分离器和离心实施在方法步骤b)中所述生产的固体邻氨基苯甲酸的所述分离。5.根据权利要求1或2的方法，其中通过用合适的溶剂萃取实施在方法步骤b)中所述生产的邻氨基苯甲酸的所述分离。6.权利要求5的方法，其中从已从所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：G耶格，AS穆萨，S克拉夫尔，T哈梅丁格，W克勒克纳，S本肯，
申请(专利权)人：科思创德国股份有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE