Compositions and methods containing polypolynucleotides and peptides with EPSP (5 enol acetone shikimate 3 phosphophosphate synthase (EPSPS)) activity are provided. In specific embodiments, the sequence has improved properties, for example, but is not limited to the improved catalytic capability in the presence of glyphosate. Nucleic acid constructs, plants, plant cells, explants, seeds and seeds with EPSPS sequences were further provided. Different methods for using EPSPS sequences are provided. Such methods include methods for producing glyphosate tolerant plants, plant cells, explants or seeds, and methods of controlling weeds in fields containing plants and / or seed crops that have been published in this article.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】植物EPSP合酶和使用方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年9月30日提交的美国临时申请号62/234,818的权益，将其全部内容通过引用特此结合。专利
本领域涉及分子生物学的领域。更具体地，它涉及赋予对草甘膦的耐受性的序列。以电子方式提交的序列表的引用该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“BB2501PCT_SequenceListing_ST25.txt”，创建于2016年9月19日，且具有96千字节大小，并与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
技术介绍
EPSP(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸)合酶是催化磷酸烯醇丙酮酸和3-磷酸莽草酸转化为磷酸和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)的酶，并且它参与芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸的生物合成。草甘膦(世界上最畅销的除草剂)起到磷酸烯醇丙酮酸的竞争性抑制剂的作用。已经通过将草甘膦不敏感的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)酶引入植物，产生了草甘膦耐受性作物。在一个实例中，玉米事件NK603使用来自农杆菌属物种菌株CP4的EPSPS。该酶对于草甘膦的抑制是高度不敏感的，同时它保留了与天然植物酶相似的催化效率(Sikorski和Gruys.1997.Acc.Chem.Res.[化学研究述评]30：2-8)。在另一实例中，玉米事件GA21使用双重突变型玉米EPSPS，其中在位置103的苏氨酸被改变为异亮氨酸，并且在位置107的脯氨酸被改变为丝氨酸。具有提供对草甘膦的充分...
【技术保护点】
1.一种多核苷酸，其编码植物EPSP合酶(EPSPS)多肽，其中该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个或多个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R，b)A4W，c)H54M，d)A72Q，e)K84R，f)L98C，g)K173R，h)I208L，i)K243E，j)T279A，k)E302S，l)T361S，m)E391P，n)E391G，o)D402G，p)A416G，q)V438R，r)S440R，s)T441Q，以及t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQ ID NO：1中列出的氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.30 US 62/2348181.一种多核苷酸，其编码植物EPSP合酶(EPSPS)多肽，其中该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个或多个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R，b)A4W，c)H54M，d)A72Q，e)K84R，f)L98C，g)K173R，h)I208L，i)K243E，j)T279A，k)E302S，l)T361S，m)E391P，n)E391G，o)D402G，p)A416G，q)V438R，r)S440R，s)T441Q，以及t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO：1中列出的氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO：2具有至少90％同一性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个或更多个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)-(t)。3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A4W、H54M、L98C、G102A、K173R、I208L、K243E、E302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。4.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。5.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码植物EPSPS多肽，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、K84R、L98C、G102A、I208L、K243E、E391P、以及D402G。6.如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸编码SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、或SEQIDNO：6中列出的植物EPSPS多肽。7.一种重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸。8.一种植物细胞，该植物细胞包含如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸或如权利要求7所述的重组DNA构建体。9.如权利要求8所述的植物细胞，其中所述植物细胞是玉米细胞。10.一种植物，在其基因组中包含如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸或如权利要求7所述的重组DNA构建体。11.如权利要求10所述的植物，其中所述植物是玉米。12.一种产生草甘膦耐受性植物的方法，该方法包括：a)在可再生植物细胞中表达包含可操作地连接到至少一种调节序列的多核苷酸的重组DNA构建体，其中该多核苷酸编码植物EPSP合酶(EPSPS)多肽，该EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：i.A2R，ii.A4W，iii.H54M，iv.A72Q，v.K84R，vi.L98C，vii.K173R，viii.I208L，ix.K243E，x.T279A，xi.E302S，xii.T361S，xiii.E391P，xiv.E391G，xv.D402G，xvi.A416G，xvii.V438R，xviii.S440R，xix.T441Q，以及xx.F442V；其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO：1中列出的氨基酸位置，并且其中该植物EPSPS多肽包含与SEQIDNO：2具有至少90％同一性的序列；以及b)产生该草甘膦耐受性植物，其中该草甘膦耐受性植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体。13.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少两个氨基酸突变，该组由以下组成：(a)-(t)。14.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含：A4W、H54ML98C、G102A、K173RI208L、K243EE302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。15.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、T441Q。16.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、K84R、L98C、K208L、K243E、E391P、以及D402G。17.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在植物细胞中表达重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含编码植物EPSPS多肽的多核苷酸，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、或SEQIDNO：6中列出的氨基酸序列。18.一种产生草甘膦耐受性植物的方法，所述方法包括：a.修饰植物细胞中的内源植物EPSP合酶(EPSPS)基因以编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：i.A2R，ii.A4W，iii.H54M，iv.A72Q，v.K84R，vi.L98C，vii.K173R，viii.I208L，ix.K243E，x.T279A，xi.E302S，xii.T361S，xiii.E391P，xiv.E391G，xv.D402G，xvi.A416G，xvii.V438R，xviii.S440R，xix.T441Q，以及xx.F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO：1中列出的氨基酸位置，并且其中该内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO：2具有至少90％同一性的序列；以及b.从所述植物细胞生长植物，其中所述植物是对草甘膦耐受的。19.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白具有选自下组的氨基酸突变中的至少两个，该组由以下组成：(a)(i)-(a)(xx)。20.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含：A4W、H54ML98C、G102A、K173RI208L、K243EE302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。21.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。22.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白包含：A2R、A4W、K84R、L98C、K208L、K243E、E391P、以及D402G。23.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的内源植物EPSPS基因编码草甘膦耐受性EPSPS蛋白，该草甘膦耐受性EPSPS蛋白具有SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、或SEQIDNO：6中列出的氨基酸序列。24.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过CRISPR/Cas指导RNA介导的系统进行修饰。25.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过锌指核酸酶介导的系统进行修饰。26.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过大范围核酸酶介导的系统进行修饰。27.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中该内源植物EPSPS基因已经通过寡核碱基介导的系统进行修饰。28.一种多核苷酸构建体，该多核苷酸构建体在植物细胞中提供指导RNA，其中该指导RNA靶向植物细胞的内源EPSP合酶(EPSPS)基因，并且所述多核苷酸构建体进一步包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：a)A2R，b)A4W，c)H54M，d)A72Q，e)K84R，f)L98C，g)K173R，h)I208L，i)K243E，j)T279A，k)E302S，l)T361S，m)E391P，n)E391G，o)D402G，p)A416G，q)V438R，r)S440R，s)T441Q，以及t)F442V，其中每个氨基酸突变位置对应于SEQIDNO：1中列出的氨基酸位置，并且其中该内源植物EPSPS基因编码多肽，该多肽包含与SEQIDNO：2具有至少90％同一性的序列。29.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽具有选自下组的氨基酸突变中的至少两个，该组由以下组成：a)-t)。30.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含：A4W、H54ML98C、G102A、K173RI208L、K243EE302S、T361S、E391P、D402G、A416G、V438R、S440R、T441Q、以及F442V。31.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、A72Q、K84R、L98C、G102A、I208L、T279A、E302S、T361S、E391G、D402G、A416G、V438R、以及T441Q。32.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含：A2R、A4W、K84R、L98C、K208L、K243E、E391P、以及D402G。33.如权利要求28所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含一种或多种多核苷酸修饰模板以产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的内源EPSPS基因，该植物EPSPS多肽具有SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、或SEQIDNO：6中列出的氨基酸序列。34.一种用于生产草甘膦耐受性植物的方法，该方法包括：a)提供指导RNA、至少一种多核苷酸修饰模板、以及至少一种Cas内切核酸酶至植物细胞，其中该至少一种Cas内切核酸酶在该植物细胞中的内源EPSP合酶(EPSPS)基因处引入双链断裂，并且其中所述多核苷酸修饰模板用于产生编码植物EPSPS多肽的、修饰的EPSPS基因，该植物EPSPS多肽包含G102A和选自下组的至少一个氨基酸突变，该组由以下组成：i.A2R，ii.A4W，iii.H54M，iv.A72Q，v.K84R，vi.L98C，vii.K173R，viii.I208L，ix.K243E，x.T279A，xi.E302S，xii.T361S，xiii...
【专利技术属性】
技术研发人员：董玉霞，M拉斯纳，吕健，E吴，PA帕滕，D西尔，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国,US
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