倍数孢子体形成基因制造技术

本发明专利技术提供了Dip基因的核苷酸序列和氨基酸序列以及其(功能性)同源物、片段和变体，其提供了倍数孢子体形成作为无融合生殖的一部分。还提供了倍数孢子体形成植物及其制备方法以及使用它们的方法，和制备无融合生殖种子的方法。

Multiplier sporophyte formation gene

The invention provides the nucleotide sequence and amino acid sequence of the Dip gene, as well as its (functional) homology, fragments and variants, which provide the formation of multiple sporophyte as part of apomixis. Multiple sporophyte forming plants are also provided, as well as a preparation method, a method for using them, and a method for preparing apomixis seeds.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】倍数孢子体形成基因
本专利技术涉及生物
，并具体涉及包括无性植物育种的植物生物技术。具体而言，本专利技术涉及鉴定与无融合生殖(特别是通过倍数孢子体形成(diplospory)的配子体无融合生殖)过程相关的基因、其变体或片段以及它们编码的蛋白质和肽。本专利技术还涉及使用本专利技术的基因、蛋白质、变体和片段在植物和农作物中通过倍数孢子体形成诱导配子体无融合生殖的方法，以及产生倍数孢子体形成植物和无融合生殖种子的方法。
技术介绍
在植物学中，无融合生殖(也称为不完全无配生殖)是指通过无性过程形成种子。无融合生殖通过一系列发育过程而发生，这些发育过程共同将植物的有性发育程序转化为无性发育程序。据报道，在400多种开花植物物种中存在复发性无融合生殖(Bicknell和Koltunow，2004)。无融合生殖可以以不同的形式出现，包括被称为配子体无融合生殖和孢子体无融合生殖(也称为不定胚形状(adventivesembryony))的至少两种形式。其中配子体无融合生殖发生的植物实例包括蒲公英(Taraxacumsp.)、山柳菊(Hieraciumsp.)、草地早熟禾(Poapratensis)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)等。发生孢子体无融合生殖的植物的例子包括柑橘属(Citrussp.)、山竹(Garciniamangostana)等。对无融合生殖总体上的兴趣(尤其是对配子体无融合生殖的兴趣)由于它对农业(特别是为了克隆种子生产的目的)的潜在用途而在过去的几十年里增加了。配子体无融合生殖的特点是至少有两个发育过程：(1)避免减数分裂(不完全减数分裂)；和(2)卵细胞发育成胚而不受精(孤雌生殖)。由配子体无融合生殖过程产生的种子被称为无融合生殖种子。由于无融合生殖种子在遗传上与母本植物相同，它们被认为是母本植物的克隆，并因此产生这种种子的过程被称为克隆种子生产。长期以来人们认识到无融合生殖在植物育种中非常有用(Asker1979，Hermsen，JGTh.1980.Breedingforapomixisinpotato：Pursuingautopianscheme.Euphytica29：595-607，AskerandJerling1990，DeVielleCalzada等，1995)。无融合生殖的优势是能够对具有杂种优势的F1杂种实现真实遗传(truebreeding)(即具有统一遗传品质的F1杂种的无限增殖)。在大多数作物中，F1杂种是最好的品种，因为它们往往与较高的产量相关，这种现象通常称为“杂种优势”。由于F1杂种的自花授粉导致F2有性作物通过重组丧失杂种优势，F1代杂种的每代必须通过杂交近交纯合亲本再次产生。生产有性F1种子是一个复杂而昂贵的过程，需要不断重复。相反，无融合生殖F1杂种是真实遗传生物，即其能够纯育。在农业中，对无融合生殖具有极大的兴趣，因为它具有固定有利基因型的能力(无论其遗传复杂性如何)，并且允许生产能够一步纯育的生物体。这意味着无融合生殖可用于即刻固定感兴趣的多基因的数量性状。应该指出的是，大多数产量性状是多基因的。无性生殖可用于多种性状(例如各种抗性、几种转基因或多种数量性状基因座)的堆积(或堆叠)。如果没有无融合生殖，为了固定这样的一系列性状，每个性状基因座必须单独制成纯合子，且然后再组合成杂种。随着涉及性状的基因座数目的增加，通过杂交产生纯合性状基因座是费力的、耗时的和具有逻辑挑战性的。同样，为F1杂种选择合适的亲本种系需要投入大量时间和精力。此外，等位基因之间的特定上位相互作用在纯合(亲本系)阶段中丧失，并且可能不会在F1杂种中组合时恢复。通过无融合生殖，使固定这种非加性遗传变异成为可能。除了即时固定任何基因型(无论其复杂性如何)外，无性生殖还有其他重要的农业用途。由于减数分裂问题，有性种间杂种和自聚倍体经常发生不育。由于无融合生殖体跳过减数分裂，所以在种间杂交种和自聚倍体中出现的这些问题将被解决。由于无融合生殖阻止雌性杂交，因此已经提出将无融合生殖与雄性不育相结合用于对转基因加以控制，从而防止在转基因作物野生亲属中出现转基因渐渗杂交(Daniell，H.2002.Molecularstrategiesforgenecontainmentintransgeniccrops.Naturebiotechnology20：581-586)。在昆虫授粉作物(例如芸苔属)中，无融合生殖种子形成不会因传粉者服务不足而受到限制。鉴于授粉蜜蜂种群日益严重的健康问题(瓦螨感染、非洲杀戮蜂等)，这一点变得越来越重要。由于大多数病毒不通过种子传播，对于块茎繁殖作物(如马铃薯)可利用无融合生殖以克隆的方式保持优良基因型，而消除通过块茎传播病毒的风险。无融合生殖种子的储存成本也会低于块茎。在观赏植物中，无融合生殖可取代劳动密集型和昂贵的组织培养繁殖。众所周知，无融合生殖通常会大大降低品种发育和繁殖的成本。主要农作物不发生无融合生殖，其中大部分是有性的种子作物。已有众多尝试试图在有性作物中引入无融合生殖。具体而言，由于无融合生殖受遗传调控，许多人试图鉴定参与无融合生殖过程的基因。在天然无融合生殖植物中，已经发现了无融合生殖为无融合生殖基因的来源(Ozias-Akins，P.andP.J.vanDijk.2007in：Annu.Rev.Genet.41：509-537)。然而，对于无融合生殖的遗传学和分子背景仍然知之甚少，并且对鉴定无融合生殖基因的尝试迄今尚未产生适用于农业的基因。这主要是由于鉴定和分离无融合生殖基因已被证明是一项困难的任务。天然无融合生殖植物通常是多倍体，而在多倍体植物中难以进行定位克隆。其他复杂因素是抑制无融合生殖特异性染色体区域中的重组、重复序列和杂交中的分离畸变。此外，无融合生殖植物的基因组还没有被测序，这使整个无融合生殖基因的搜索变得复杂。因此，无融合生殖基因尚未被克隆和/或分离。尝试在有性作物中引入无融合生殖可概括如下：a)通过广泛杂交将野生无融合生殖植物中的无融合生殖(无融合生殖的)基因渐渗杂交入作物物种迄今尚未成功，例如，试图将无融合生殖从鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)转移到玉米和小米[Savidan,Y.(2001).Transferofapomixisthroughwidecrosses.InFloweringofApomixis:FromMechanismstoGeneticEngineering,Y.；apomixisfromPennisetumsquamulatumintopearlmillet.Savidan,J.G.Carman,andT.Dresselhaus,eds(Mexico:CIMMYT,IRD,EuropeanCommissionDGVI),pp.153–167；Morgan,R.,Ozias-Akins,P.,andHanna,W.W.(1998).SeedsetinanapomicticBC3pearlmillet.Int.J.PlantSci.159,89–97.；WO97/10704.]。b)有性模式物种的突变体，特别是在拟南芥中。例如，WO2007066214描述了在拟南芥中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的核酸序列或与SEQ ID NO：1的核酸序列具有至少50％或70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％或97％，最优选至少98％或99％序列同一性的核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.04 NL 20153981.分离的多核苷酸，其包含SEQIDNO：1的核酸序列或与SEQIDNO：1的核酸序列具有至少50％或70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％或97％，最优选至少98％或99％序列同一性的核酸序列。2.分离的多核苷酸，其包含SEQIDNO：2的核酸序列或与SEQIDNO：2的核酸序列具有至少50％或70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％或97％，最优选至少98％或99％序列同一性的核酸序列。3.根据权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含或具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的核酸序列。4.根据权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸和/或所述多核苷酸的表达产物和/或由所述多核苷酸编码的蛋白质能够向植物或植物细胞提供倍数孢子体形成功能。5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中当引入进植物或植物细胞时，所述多核苷酸和/或所述多核苷酸的表达产物和/或由所述多核苷酸编码的蛋白质向植物或植物细胞提供倍数孢子体形成功能。6.根据权利要求4-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述表达产物是RNA分子，优选为mRNA分子、siRNA或miRNA分子。7.根据权利要求1-3中任一项的多核苷酸的片段，其中所述片段和/或所述片段的表达产物和/或由所述片段编码的蛋白质能够向植物或植物细胞提供倍数孢子体形成功能。8.根据权利要求7所述的片段，其中当引入进植物或植物细胞时，所述片段和/或所述片段的表达产物和/或由所述片段编码的蛋白质向植物或植物细胞提供倍数孢子体形成功能。9.根据权利要求7-8中任一项所述的片段，其中所述表达产物是RNA分子，优选为mRNA分子、siRNA或miRNA分子。10.权利要求9所述的片段，其中所述表达产物包含或具有SEQIDNO：5的核酸序列。11.根据权利要求7-8中任一项所述的片段，其中所述片段包含或具有SEQIDNO：4或6的核酸序列。12.根据权利要求7-11中任一项所述的片段，其中所述片段的长度为所述多核苷酸的至少20、30、40、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000或3000个连续核苷酸。13.分离的多肽，其包含SEQIDNO：3的氨基酸序列或与SEQIDNO：3的氨基酸序列具有至少50％或70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％或97％，最优选至少98％或99％序列同一性的氨基酸序列。14.根据权利要求13所述的多肽，其中所述多肽包含或具有SEQIDNO：3的氨基酸序列。15.根据权利要求13-14中任一项所述的多肽，其中所述多肽能够向植物或植物细胞提供倍数孢子体形成功能。16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽在引入进植物或植物细胞时向植物或植物细胞提供倍数孢子体形成功能。17.根据权利要求13-14中任一项所述的多肽的片段，其中所述片段能够向植物或植物细胞提供倍数孢子体形成功能。18.根据权利要求17所述的片段，其中所述片段包含SEQIDNO：7或SEQIDNO：12的氨基酸序列。19.根据权利要求17-18中任一项所述的片段，其中所述片段的长度为所述多肽的至少10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、400或500个连续氨基酸。20.一种嵌合基因，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求7-12中任一项所述的片段。21.一种遗传构建体，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求7-12中任一项所述的片段或根据权利要求20所述的嵌合基因。22.基因构建体，其在5'-3'方向上包含编码根据权利要求13-19中任一项的多肽或片段的开放读码框多核苷酸。23.一种核酸载体，其包含在植物细胞中有活性的启动子序列，所述启动子序列可操作地连接于根据权利要求1-6中任一项的多核苷酸、根据权利要求7-12中任一项的片段、根据权利要求20的嵌合基因或根据权利要求21-22中任一项的遗传构建体。24.权利要求23的核酸载体，其中所述启动子序列包含：e)SEQIDNO：2的核酸序列的天然启动子序列；f)a)的启动子序列的功能性片段；或者g)包含与SEQIDNO：2的核酸序列的天然启动子序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％序列同一性的核酸序列；h)SEQIDNO：6的核酸序列的天然启动子序列；i)d)的启动子序列的功能性片段；或者j)包含与SEQIDNO：6的核酸序列的天然启动子序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％序列同一性的核酸序列。25.权利要求23的核酸载体，其中所述启动子是雌性子房特异性启动子，优选大孢子母细胞特异性启动子和/或雌性配子特异性启动子。26.植物、植物部分或植物细胞，其包含权利要求20的嵌合基因、权利要求21-22中任一项的遗传构建体和/或权利要求23-25中任一项的核酸载体，其中所述基因、构建体和/或载体至少在雌性子房中存在和/或表达，优选在大孢子母细胞中和/或在雌性配子中表达。27.根据权利要求26所述的植物的种子，其中所述种子是所述植物的无融...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·J·范戴克，D·里格拉，M·W·普林森，A·J·范杜能，
申请(专利权)人：主基因有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL