液滴测序中的稀疏标识空间制造技术

描述了用于确定靶核酸的序列的方法。该方法使用具有已知序列和独特标识的多个对照寡核苷酸将与多个测序探针相关联的杂交信号映射至松散堆积的多维染料空间，使得染料空间中的区域可以与一个或多个测序探针相关联。当测序探针和靶核酸的检测到的靶杂交信号被映射至多维染料空间时，可以基于与该检测到的靶杂交信号所映射至的区域相关联一个或多个测序探针确定测序探针以及因此靶核酸中的相应核苷酸。

Sparse identification space in droplet sequencing

A method for determining the sequence of target nucleic acids is described. This method maps hybrid signals associated with multiple sequencing probes into a loosely stacked multidimensional dye space using a plurality of controlled oligonucleotides with a known sequence and unique identification, so that the region in the dye space can be associated with one or more sequencing probes. When the target hybridization signal detected by the sequencing probe and the target nucleic acid is mapped to the multidimensional dye space, the sequencing probe and the corresponding nucleotide in the target nucleic acid can be determined on the basis of one or more sequencing probes that are mapped to the target hybridization signal detected by the detected target.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】液滴测序中的稀疏标识空间
技术介绍
脱氧核糖核酸(DNA)测序是确定DNA分子中核苷酸的精确顺序的过程，例如DNA链中四种碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的顺序。DNA序列的知识已用于基础生物学研究和多种应用领域，例如诊断、生物技术、法医生物学和生物系统学。使用现代DNA测序技术获得快速测序已被用于完整DNA序列或多种类型和物种的基因组(包括人基因组和许多动物、植物和微生物物种的其他完整DNA序列)的测序。这些快速DNA测序方法的出现极大地加速了生物和药学研究和发现。通过杂交测序(SBH)是基于靶核酸与大量不同探针序列的杂交或缺少该杂交的测序方法。通过检测重叠探针的杂交和类似但不同序列探针的杂交不存在，可预测靶序列的核苷酸序列。然而，由于测序系统中的噪声、错误或其他缺陷，检测到的杂交信号在映射至用于试验应答的染料空间时可能重叠且密集地包装，因此难以相互区分以正确鉴定哪些探针与给定的靶核酸杂交。
技术实现思路
本文提供了用于确定靶核酸(例如，生物体的基因组区域)的核苷酸序列的方法。在一些实施方案中，该方法包括接收对照杂交信号，该信号指示来自多个测序探针的测序探针与来自多个对照分区的各对照分区的多个对照液滴的各对照液滴中的相应对照寡核苷酸的拷贝之间的杂交。多个对照液滴中的各对照液滴包括多个对照寡核苷酸的相应对照寡核苷酸的拷贝。多个对照寡核苷酸中的各对照寡核苷酸具有已知序列和相应的标识(ID)。方法进一步包括就各对照分区的多个对照液滴中的各对照液滴确定对照液滴中对照寡核苷酸的标识(ID)；将各对照液滴的对照杂交信号映射至染料空间中的多维对照数据点；并且存储与各对照液滴的对照寡核苷酸的ID相关的多维对照数据点。对于多个测序探针中的各测序探针，方法还包括基于多个对照寡核苷酸的已知序列获得测序探针位向量，其中测序探针位向量中的每个位表示在多个对照寡核苷酸的相应对照寡核苷酸中存在或不存在该测序探针。方法还可以包括：接收用于包括靶核酸拷贝的第一靶分区的第一靶液滴的第一靶杂交信号；将所述第一靶杂交信号映射至染料空间中的第一多维靶数据点；选择包括第一多维靶数据点的染料空间中的区域；生成该区域的区域向量，其中该区域向量中的各值表示该区域内具有相应对照寡核苷酸的ID的任何多维对照数据点的贡献；以及就所述第一测序探针基于所述区域向量与所述测序探针位向量之间的匹配条件，将第一测序探针鉴定为与所述靶核酸杂交。本文还提供了用于确定靶核酸中的核苷酸序列的另一种方法。该方法包括通过SBH系统接收多个对照分区，其中所述多个对照分区的各对照分区包括来自多个对照寡核苷酸的相应对照寡核苷酸的拷贝，并且所述多个对照寡核苷酸中的各对照寡核苷酸具有已知序列和相应的标识(ID)；以及将所述多个对照分区的各对照分区分成多个对照液滴，各对照液滴包括用于所述对照分区的所述对照寡核苷酸的多个拷贝。所述方法进一步包括检测对照杂交信号，所述对照杂交信号指示，就多个对照液滴的第一部分中的各对照液滴来说，来自多个测序探针的测序探针与对照液滴中的对照寡核苷酸的拷贝的杂交；确定各对照液滴中对照寡核苷酸的ID；将多个对照液滴的第一部分中的各对照液滴的对照杂交信号映射至染料空间中的多维对照数据点；并存储与相应对照寡核苷酸的ID相关联的多维对照数据点。该方法还包括基于多个对照寡核苷酸的已知序列接收或以其他方式获得测序探针位向量，其中测序探针位向量中的每个位表示多个对照寡核苷酸的相应对照寡核苷酸中是否存在测序探针。方法还可以包括：接收用于包括靶核酸拷贝的第一靶分区的第一靶液滴的第一靶杂交信号，并且将所述第一靶杂交信号映射至染料空间中的第一多维靶数据点；选择包括第一多维靶数据点的染料空间中的区域；生成该区域的区域向量，其中该区域向量中的各值表示该区域内具有相应对照寡核苷酸的ID的任何多维对照数据点的贡献；以及就所述第一测序探针基于所述区域向量与第一测序探针位向量之间的匹配条件，将第一测序探针鉴定为与所述靶核酸杂交。或者，可以为染料空间中的各区域或各相干区域创建区域向量。可以将区域向量与各测序探针的测序探针位向量进行比较，以确定对应于各区域的一个或多个测序探针。在测序运行之后或在测序运行期间，包含靶核酸拷贝的靶液滴的靶杂交信号可被映射至染料空间中的多维靶数据点。对于染料空间中的各靶数据点，基于与靶数据点落入染料空间的区域相对应的一个或多个测序探针，该一个或多个测序探针可以与靶数据点相关联。还描述了本专利技术的其他方面，包括可用于执行本文方法的微流体系统，以及包括计算机可读介质的计算机产品，该介质存储用于使系统执行本文所述方法的指令。定义术语“核酸扩增”或“扩增反应”指用于倍增核酸靶序列拷贝的任何体外方法。这种方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，脱氧核糖核酸(DNA)连接酶链反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990),QBeta核糖核酸(RNA)复制酶，和基于RNA转录的扩增反应，例如反式作用siRNA(TAS)和自主序列复制(3SR)，以及本领域技术人员已知的其它方法。“扩增”指将溶液置于足以扩增多核苷酸的条件下的步骤。扩增反应的组分包括，例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语扩增一般是指靶核酸的“指数型”增长。然而，本文所用的扩增也可指核酸的选择靶序列数量的线性增长，如由循环测序所得。“聚合酶链式反应”或“PCR”是指靶双链DNA的特定区段或子序列得以几何级数式扩增的一种方法。PCR是本领域技术人员所熟知的；参见例如，美国专利号4,683,195和4,683,202；和《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990。示例性PCR反应条件一般包括两步或三步循环。两步循环具有变性步骤，之后是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤，之后是杂交步骤，之后是独立的延伸步骤。PCR可以终点PCR(即仅在终点处监测)或定量PCR(“实时”监测)的方式进行。“引物”指与靶核酸上的序列杂交并且用作核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以是各种长度的但通常长度小于50个核苷酸，例如长度为5-30个核苷酸。可基于本领域技术人员已知的原理设计用于PCR的引物的长度和序列，参见例如Innis等(同上)。“模板”指包含待扩增的多核苷酸、其侧或为一对引物杂交位点的多核苷酸序列。因此，“靶模板”包含侧接“正向”引物和“反向”引物的杂交位点的靶多核苷酸序列。本文所用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。修饰包括但不限于，提供整合入其它电荷、极化性、氢键、静电相互作用、与核酸配体碱基或核酸配体整体的连接点和作用点的化学基团的那些修饰。这类修饰包括但不限于，肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2'-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合如异碱基(isobases)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸也可包含非天然碱基，如硝基吲哚。修饰还可包括3'和5'修饰，包括但不限于用荧光团(例如，量子点)或其他部分加帽。术语“多肽”本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定靶核酸的序列的方法，所述方法包括通过计算机系统进行：对于多个对照分区的各对照分区，各对照分区包括多个对照液滴，所述多个对照液滴的各对照液滴包括多个对照寡核苷酸的相应对照寡核苷酸的拷贝，所述多个对照寡核苷酸中的各对照寡核苷酸具有已知序列和相应的标识(ID)：对于所述对照分区的多个对照液滴的各对照液滴：接收对照杂交信号，该信号指示来自多个测序探针的测序探针与所述对照液滴中的相应对照寡核苷酸的拷贝之间的杂交；确定所述对照液滴中的对照寡核苷酸的ID；将所述对照杂交信号映射至染料空间中的多维对照数据点；和存储与所述对照寡核苷酸的ID相关的多维对照数据点；对于所述多个测序探针的各测序探针：基于所述多个对照寡核苷酸的已知序列接收测序探针位向量，其中测序探针位向量中的每个位表示多个对照寡核苷酸的相应对照寡核苷酸中是否存在该测序探针；就包括所述靶核酸的拷贝的第一靶分区的第一靶液滴，接收第一靶杂交信号；将所述第一靶杂交信号映射至染料空间中的第一多维靶数据点；选择包括所述第一多维靶数据点的染料空间中的区域；生成所述区域的区域向量，其中所述区域向量中的各值表示所述区域内具有所述相应对照寡核苷酸的ID的任何多维对照数据点的贡献；和基于所述区域向量与就第一测序探针的第一测序探针位向量之间的匹配条件，将第一测序探针鉴定为与所述靶核酸杂交。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.20 US 62/258,3701.一种确定靶核酸的序列的方法，所述方法包括通过计算机系统进行：对于多个对照分区的各对照分区，各对照分区包括多个对照液滴，所述多个对照液滴的各对照液滴包括多个对照寡核苷酸的相应对照寡核苷酸的拷贝，所述多个对照寡核苷酸中的各对照寡核苷酸具有已知序列和相应的标识(ID)：对于所述对照分区的多个对照液滴的各对照液滴：接收对照杂交信号，该信号指示来自多个测序探针的测序探针与所述对照液滴中的相应对照寡核苷酸的拷贝之间的杂交；确定所述对照液滴中的对照寡核苷酸的ID；将所述对照杂交信号映射至染料空间中的多维对照数据点；和存储与所述对照寡核苷酸的ID相关的多维对照数据点；对于所述多个测序探针的各测序探针：基于所述多个对照寡核苷酸的已知序列接收测序探针位向量，其中测序探针位向量中的每个位表示多个对照寡核苷酸的相应对照寡核苷酸中是否存在该测序探针；就包括所述靶核酸的拷贝的第一靶分区的第一靶液滴，接收第一靶杂交信号；将所述第一靶杂交信号映射至染料空间中的第一多维靶数据点；选择包括所述第一多维靶数据点的染料空间中的区域；生成所述区域的区域向量，其中所述区域向量中的各值表示所述区域内具有所述相应对照寡核苷酸的ID的任何多维对照数据点的贡献；和基于所述区域向量与就第一测序探针的第一测序探针位向量之间的匹配条件，将第一测序探针鉴定为与所述靶核酸杂交。2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：就包括所述靶核酸的拷贝的多个靶液滴，接收多个靶杂交信号；将所述多个靶杂交信号映射至染料空间中的多维靶数据点；基于所述染料空间中所述多维靶数据点的区域，鉴定与所述靶核酸杂交的测序探针；和基于与所述靶核酸杂交的测序探针，组装所述靶核酸的序列。3.如权利要求1所述的方法，其中各对照寡核苷酸中碱基对的数量小于所述多个测序探针中测序探针的数量的20％。4.如权利要求1所述的方法，其中各测序探针可以与所述多个对照寡核苷酸的一个或多个对照寡核苷酸杂交。5.如权利要求1所述的方法，其中各对照分区中的对照寡核苷酸包含来自多个对照标志物的对照标志物作为所述对照寡核苷酸的相应ID，所述多个对照标志物可由多个对照标志物探针检测到。6.如权利要求5所述的方法，其中所述对照标志物探针被配置成使得与所述多个对照标志物探针关联的对照杂交信号和与所述多个测序探针关联的对照杂交信号可以被映射至所述染料空间的不同区域中的数据点。7.如权利要求1所述的方法，其中确定所述对照液滴中的所述对照寡核苷酸的ID包括：从相同的对照分区鉴定对照液滴；和基于在来自所述对照分区的至少一些对照液滴中检测到的对照标志物探针，确定来自所述相同对照分区的对照液滴的相应对照寡核苷酸的ID。8.如权利要求7所述的方法，其中鉴定来自所述相同对照分区的对照液滴包括确定时间窗，在该时间窗中对应于与对照寡核苷酸相关的对照标志物探针的对照杂交信号比对应于其他对照标志物探针的对照杂交信号更频繁地被检测到。9.权利要求1所述的方法，其中各测序探针包含荧光部分，并且各对照液滴的对照杂交信号对应于荧光信号。10.如权利要求1所述的方法，其中，鉴定所述第一测序探针包括基于所述区域向量与所述第一测序探针的第一测序探针位向量之间的匹配条件以及所述区域向量与其他测序探针的测序探针位向量之间的匹配条件，来确定所述区域对应于所述第一测序探针的概率值。11.如权利要求1所述的方法，其中所述染料空间中的区域经选择，使得所述区域的所述区域向量与测序探针位向量具有最佳匹配。12.一种对靶核酸进行测序的方法，所述方法包括：接受多个对照分区，其中所述多个对照分区的各对照分区包括来自多个对照寡核苷酸的相应对照寡核苷酸的拷贝，其中所述多个对照寡核苷酸中的各对照寡核苷酸具有已知序列和相应的标识(ID)；对于所述多个对照分区的各对照分区：将所述对照分区分成多个对照液滴，各对照液滴包括就所述对照分区的对照寡核苷酸的多个拷贝；和对于所述多个对...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·希利，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US