向天然杀伤细胞、造血干细胞和巨噬细胞的增强化基因递送制造技术

本发明专利技术包括一种通过给予奥索恩诺((5Z)‑7‑Oxozeaenol)下调胞内防御的方法。该方法能改善基于RNA的基因载体向天然杀伤细胞、干细胞和巨噬细胞的递送。所得细胞能用于过继细胞转移疗法。还提供了通过给予奥索恩诺和抗病毒治疗来治疗病毒诱导的炎症的方法。

Delivery of enhancements to natural killer cells, hematopoietic stem cells and macrophages

The invention includes a method of reducing intracellular defense by giving Orsouw Enno ((5Z) 7 Oxozeaenol). This method can improve the delivery of RNA based gene vectors to natural killer cells, stem cells and macrophages. The derived cells can be used for adoptive cell transfer therapy. It also provides a way to treat viral induced inflammation by giving Orsouw Enno and antiviral therapy.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】向天然杀伤细胞、造血干细胞和巨噬细胞的增强化基因递送优先权和引用纳入本申请要求2015年9月30日提交的临时申请62/235,427的优先权。本文所引用的所有文献通过引用明确纳入本文。
技术介绍
天然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统中的淋巴细胞。它们产生细胞因子并具有细胞毒作用，从而杀伤被病毒感染的细胞或肿瘤细胞。因此，采用NK细胞的过继免疫疗法是癌症治疗中具有前景的方式。在过去十年中，数种基于NK细胞的抗癌产品已进入临床试验阶段，且获得了理想的临床结果。然而，为了制造更有效的NK细胞疗法产品，开发出新的策略(例如NK细胞的基因修饰)至关重要。并且，采用通过引入活化或嵌合抗原受体来重定向于肿瘤靶标的基因修饰NK细胞在进一步的临床应用中展示出诱人前景。导入表达各种细胞因子的基因以提高过继性转移的NK细胞的体内存活和细胞毒性也是各种方式中的一种。仍然存在的问题是NK细胞对逆转录病毒的固有抗性(Lanier2008；Alici等,2009；Brandstadler和Yang,2011；Sutlu等,2012)。业已显示通过提高增殖和用小分子抑制剂靶向胞内病毒防御机制能够增强向NK细胞的逆转录病毒和慢病毒基因递送。但通过病毒载体向巨噬细胞和干细胞递送遗传物质还是个问题。本领域中仍然需要更有效地转染细胞，尤其是转染NK细胞、造血干细胞和巨噬细胞。本专利技术的一个目的是通过共同给予奥索恩诺((5Z)-7-Oxozeaenol)和病毒载体来改善细胞转染。本专利技术的一个目的是通过给予奥索恩诺来下调胞内防御机制。本专利技术的一个目的是通过给予细胞奥索恩诺来改善过继细胞转移治疗。本专利技术的一个目的是通过给予天然杀伤细胞、巨噬细胞和干细胞奥索恩诺和病毒载体来改善对这些细胞的转染。本专利技术的一个目的是采用以表达载体和奥索恩诺转染的细胞来治疗人类疾病。本专利技术的一个目的是用基于慢病毒或逆转录病毒的载体来转导细胞。本专利技术的一个目的是采用以奥索恩诺和RNA病毒载体转染的细胞来治疗癌症和增殖性疾病。本专利技术的一个目的是采用以奥索恩诺和RNA病毒载体转染的细胞来治疗由遗传突变引起的疾病。本专利技术的一个目的是采用以奥索恩诺和RNA病毒载体转染的细胞来治疗代谢性疾病。本专利技术的一个目的是治疗由病毒感染引起的炎症。
技术实现思路
本专利技术包括在体外给予细胞奥索恩诺和RNA病毒载体以改善转染，并由此增强NK细胞、干细胞和巨噬细胞的增殖。虽然不希望受到任何理论的限制，据信所观察到的基因修饰增加是由于下调了由RigI介导的胞内防御机制。通过该方式处理的细胞能用于治疗癌症、由已知基因突变导致的疾病以及由已知基因突变导致的代谢性疾病。附图简要说明图1包括两张柱状图，显示了采用iX的先天免疫信号传导抑制在NK细胞中增强了慢病毒转导效率。在6μMBX795或iX的存在下，对NK-92细胞和分离自健康供体PBMC的原代人NK细胞进行6小时的慢病毒转导。在72小时后获得GFP表达。+图中显示了细胞百分比。图2A的图表显示iX对NK细胞具有剂量依赖性效果且低毒。在不同剂量BX795或iX的存在下，用LeGO-G2病毒转导原代人NK细胞和NK-92细胞6小时。转导后72小时，用流式细胞术分析GFP表达。图中显示了GFP+细胞的百分比。数据获自三个独立的试验，各重复三次。图2B包含两张柱状图，图中比较了凋亡和死亡膜联蛋白-V+/PI-细胞。图3包含凝胶照片，显示了在慢病毒转导期间用iX处理减少了RIG-I和IRF-3。图4包含两张柱状图，显示了iX处理干扰了抗病毒细胞因子IFNγ和TNF的分泌。图5显示了与BX795相比，iX处理具有独特的转录组标记。图6A-D显示据信被BXx795影响的信号传导途径。图6E-H显示据信被iX影响的信号传导途径。图7显示给予iX增加基因编辑。专利技术详述细胞疗法迅速成为用于治疗哺乳动物疾病的可行方法。然而不幸的是，许多治疗应用受限于基因能被递送到靶细胞的低效性。在如下所述的方法中合用iX获得了预料不到的结果。在这些试验事前，已知小分子可靶向RIGI并下调胞内防御机制。采用本专利技术，能够更容易地将所需基因导入靶细胞。据信iX的类似物、衍生物或模拟物也能起效。实施例1材料和方法细胞系：293FT细胞购自英杰公司(生命技术公司，美国纽约州格兰德岛)，并保存在杜尔贝科改良的伊格培养基(DMEM，GIBCO，生命技术公司，美国纽约州格兰德岛)中，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS，GIBCO)、0.1mM非必需氨基酸(Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州圣路易斯)、6mML-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich公司)、1mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich公司)和20mMHEPES(Sigma-Aldrich公司)。NK92细胞保存在CellGroSCGM(Cellgenix公司)培养基中，该培养基补充有20％FBS和1000U/mlrhIL-2(阿地白介素Proleukin，希龙公司)。慢病毒载体的生产为了生产VSV-G假型慢病毒载体，将14×106个293FT细胞接种至聚-D赖氨酸包被的150mm培养皿(美国加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司)。次日，如下转染细胞：在25μM氯喹(Sigma-Aldrich公司)的存在下，采用磷酸钙转染试剂盒(Sigma-Aldrich)，用30μgLeGO-G2质粒(德国汉堡的汉堡-埃普多夫大学医学中心的BorisFehse教授惠赠)、15μgpMDLg/pRRE(美国马萨诸塞州坎布里奇的Addgene公司)、10μgpRSV-REV(Addgene公司)和5μgphCMV-VSV-G(Addgene公司)转染细胞。转染后10小时，更换培养基，然后在2-3天内每24小时收集含病毒的上清液，存储于-80℃直至进一步使用。用每次生产的一小份通过用系列稀释量的病毒上清液转导293FT细胞来测定病毒滴度。原代天然杀伤细胞的分离和培养从位于胡丁格的卡罗林斯卡大学医院的血库获得健康供体的白细胞层。该试验方案经当地研究伦理委员会批准。通过梯度离心，采用淋巴细胞分离剂(Lymphoprep，挪威奥斯陆的Nyegaard公司)分离外周血单核细胞(PBMC)，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，GIBCO公司，美国纽约州格兰德岛)洗涤两次。通过Türk和台盼蓝染料排除法评估细胞计数和存活度。采用NK细胞分离试剂盒(德国科隆的美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotec,Cologne,Germany))和AutoMACS仪(美天旎生物技术公司)，根据制造商说明书获得NK细胞。分离后，将NK细胞以1×106个细胞/ml的浓度置于CellGroSCGM(Cellgenix公司)中培养，该CellGroSCGM中补充有10％人AB血清(瑞士巴塞尔的龙沙公司)和1000U/mlrhIL-2(阿地白介素Proleukin，希龙公司)。为了在转导前初始测试细胞因子刺激(图1)，使用了浓度为20ng/ml的IL-12(美国新泽西州洛基山的派罗科技公司(Peprotech))、IL-15(派罗科技公司)和IL-21(派罗科技公司)。其余试验中，仅使用1000U/mlrhIL-2和20ng/mlIL-21。天然杀伤细胞的慢病毒转导对于各次慢病毒转导，将NK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强向细胞的基因递送的方法，所述方法包括向营养培养基中的细胞共同给予奥索恩诺(5Z)‑7‑Oxozeaenol和RNA病毒载体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.30 US 62/235,4271.一种增强向细胞的基因递送的方法，所述方法包括向营养培养基中的细胞共同给予奥索恩诺(5Z)-7-Oxozeaenol和RNA病毒载体。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述RNA病毒载体选自：逆转录病毒载体和慢病毒载体。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述载体是逆转录病毒载体。4.如权利要求2所述的方法，其中，所述载体是慢病毒载体。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞选自天然杀伤细胞、干细胞和巨噬细胞。6.如权利要求5所述的方法，其中，所述细胞是天然杀伤细胞，其为NK92细胞。7.如权利要求1所述的方法，其中，奥索恩诺抑制所述细胞的胞内防御机制。8.如权利要求7所述的方法，其中，通过给予有效量的奥索恩诺抑制RIG-I和/或IRF3的表达。如权利要求7所述的方法，所述路径处于RIG-I和/或IRF3的下游。9.如权利要求1所述的方法，其中，奥索恩诺的给予量足以在所述营养培养基中获得约0.04μM～约10μM的浓度。10.一种抑制细胞的胞内防御机制的方法，所述方法包括给予有效量的奥索恩诺以抑制细胞的防御机制。11.如权利要求10所述的方法，其中，所述细胞选自天然杀伤细胞、干细胞和巨噬细胞。12.如权利要求10所述的方法，其中，通过给予有效量的奥索恩诺抑制RIG-I和/或IRF3的表达。13.如权利要求10所述的方法，其中，奥索恩诺的有效量是在营养培养基中约0.04μm～约10μm的浓度。14.如权利要求13所述的方法，其中，所述有效量是0.4μm～约1.5μm。15.如权利要求13所述的方法，其中，所述有效量是约0.5μm～约6μm。16.一种改善细胞转导的方法，所述方法包括使用抑制IFNλ应答的基因递送载体。17.如权利要求16所述的方法，其中，所述细胞选自天然杀伤细胞、干杀伤细胞、干细胞和巨噬细胞。18.如权利要求17所述的方法，其中，所述天然杀伤细胞为NK92细胞。19.如权利要求16所述的方法，其中，通过给予有效量的奥索恩诺抑制IFNλ应答。20.如权利要求16所述的方法，其中，奥索恩诺的有效量是约0.05μm～约1.5μm的浓度。21.一种治疗患有能用过继细胞转移治疗的疾病的患者的方法，所述方法包括给予患者用一定量奥索恩诺处理过的细胞，所述奥索恩诺的量有效抑制胞内防御机制。22.如权利要求21所述的方法，其中，抑制了RIG-I和/或IRF3。23.如权利要求22所述的方法，其中，给予奥索恩诺以获得0.2μm～6μm的目标浓度。24.如权利要求23所述的方法，其中，奥索恩诺的浓度是0.2μM～1.5μM。25.一种治疗患有能用过继细胞转移治疗的疾病的患者的方法，所述方法包括给予患者奥索恩诺和慢病毒载体。26.如权利要求25所述的方法，其中，所述疾病选自癌症和具有已知基因缺陷的疾病。27.如权利要求25所述的方法，其中，奥索恩诺的目标血浆浓度为0.2μM～6μM。28.如权利要求27所述的方法，其中，奥索恩诺的目标血浆浓度是0.2μM～1.5μM。29.一种通过RNA病毒载体来增强天然杀伤细胞中基因转化的方法，所述方法包括向营养培养基中的天然杀伤细胞共同给予奥索恩诺和RNA病毒载体。30.如权利要求29所述的方法，其中，所述载体选自：逆转录病毒载体和慢病毒载体。31.如权利要求30所述的方法，其中，所述载体是逆转录病毒载体。32.如权利要求30所述的方法，其中，所述载体是慢病毒载体。33.如权利要求30所述的方法，其中，加入奥索恩诺以在营养培养基中获得0.4μm～约10μm的浓度。34.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予通过共同给予奥索恩诺和RNA病毒载体转染的细胞。35.如权利要求34所述的方法，其中，所述癌症选自：肿瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病和母细胞瘤：急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症、肛门癌、星形细胞癌、基底细胞癌、肝外胆管癌(胆管癌)、膀胱癌、骨肿瘤(骨肉瘤/恶性纤维性组织细胞瘤)、脑干神经胶质瘤、脑癌、脑星状细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉途径和下丘脑胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增殖性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜细胞瘤、食道癌、尤因肉瘤、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(gist)、颅外或性腺外或卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、脑干胶质瘤、儿童脑星形细胞瘤胶质瘤、毛细胞白血病、头部颈部癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·阿里茨，A·杜鲁，T·苏特鲁，
申请(专利权)人：维萨列克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US