分子机器制造技术

本公开涉及分离的酶复合物，其包含栓系的辅因子和至少两种配对的酶以催化酶促反应并再循环所述辅因子。

Molecular machine

The disclosure relates to a separate enzyme complex comprising a thrombus cofactor and at least two paired enzymes to catalyze enzymatic reaction and recycle the cofactor.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分子机器专利
本公开涉及分离的酶复合物，其包含栓系的辅因子和至少两种配对的酶以催化酶促反应并且再循环所述辅因子。专利技术背景生物催化剂具有在有机合成中显著减少产生的废物和能源成本的潜力。部分地，这是因为生物催化剂(其中有许多在低温和低压下操作)的精细选择性减少了不想要的副产物形成，这具有简化下游分离的额外益处。事实上，其中酶用作催化剂的有机合成的数量因其在温和的pH和温度条件下具有优异的立体和区域特异性(Leonidat等，2001)而正在迅速增加。现在通过将酶催化剂固定在流动反应器中来进行各种工业过程。在流动反应器中固定酶催化剂具有许多有利方面，包括酶的再利用、酶的稳定化(特别是防止聚集)、连续反应过程以及防止酶对产物的污染。此外，将低价值可再生原料转化成高价值产物的偶联级联酶反应代表了可再生绿色化学的要旨。然而，当前酶系统应用于能量密集型合成反应的主要限制之一是提供可扩散辅因子或共底物的连续供应的成本(Zhao等，2003)。因此，迫切需要开发特别地用于工业过程和可再生绿色化学的改进的酶催化剂。专利技术概述本专利技术人已发现可从各种酶配对产生稳定的酶融合物。本专利技术人还发现可将各种辅因子栓系至这些融合物上以形成能够进行酶促反应和原位辅因子再生的酶复合物。因此，在一个方面，本公开涉及分离的酶复合物，其包含：a)辅因子，b)需要辅因子进行酶促反应的第一酶，和c)使辅因子再循环的第二酶，其中所述第一酶、第二酶和辅因子通过共价附接形成所述酶复合物，并且其中所述辅因子经由系链共价附接，所述系链允许所述辅因子被所述第一酶使用并被所述第二酶再循环。在一个实例中，辅因子选自由ATP/ADP、NAD+/NADH、NADP+/NADPH和FAD+/FADH2组成的组。在一个实例中，辅因子具有核糖核苷酸核心。在一个实例中，系链经由至核糖核苷酸核心的碱基部分的C-N(碳至氮)键共价附接至所述核糖核苷酸核心。在一个实例中，系链包括聚乙二醇(PEG)链、烃链、多肽、多核苷酸。在一个实例中，聚乙二醇链的长度是PEG2至PEG48(即(-CH2CH2O-)2至(-CH2CH2O-)48)。在一个实例中，聚乙二醇链的长度是PEG24(即(-CH2CH2O-)24)。在一个实例中，烃链的长度是C8-C18，在一个实例中，烃链的长度是C12-C18，在一个实例中，烃链的长度是C12。在一个实例中，辅因子被栓系至所述酶之一。在一个实例中，第一和第二酶通过接头共价附接。在一个实例中，辅因子被栓系至接头。在一个实例中，接头是氨基酸接头。在一个实例中，接头包含Cys、Thr、Glu或Lys氨基酸残基。在一个实例中，接头包含GlySerSer氨基酸残基重复序列(GlySerSer)n。在一个实例中，接头包含(GlySerSer)3Cys(GlySerSer)3。第一酶可以是能够将合适的底物转化成目标产物的任何蛋白质。合适的第一酶的实例包括但不限于激酶、脱氢酶、加氧酶、醛缩酶、还原酶和合酶。第二酶可以是能够将第一酶的辅因子转化成可被第一酶用来将合适的底物转化成目标产物的形式的任何蛋白质。合适的第二酶的实例包括但不限于激酶、脱氢酶、氧化酶、还原酶和过氧化物酶。在一个实例中，酶复合物还包含共价附接的缀合模块，用于将复合物缀合至固体支撑物。在一个实例中，缀合模块通过接头共价附接至第一酶或第二酶。在一个实例中，接头是上述实例中引用的接头。在一个实例中，缀合模块是蛋白质。可用作缀合模块的一部分的蛋白质的实例包括但不一定限于酯酶、链霉亲和素、谷胱甘肽S-转移酶、金属结合蛋白、纤维素结合蛋白、麦芽糖结合蛋白和抗体或其抗原结合片段。在一个实例中，酶复合物共价或非共价地附接至固体支撑物。在一个实例中，固体支撑物是官能化的聚合物。在一个实例中，官能化的聚合物选自但不一定限于由以下组成的组：琼脂糖、棉、聚丙烯腈、聚酯、聚酰胺、蛋白质、核酸、多糖、碳纤维、石墨烯、玻璃、二氧化硅、聚氨酯和聚苯乙烯。在一个实例中，固体支撑物呈珠粒、基质、编织纤维或凝胶形式。另一方面，本公开涉及用于产生本专利技术的酶复合物的方法，所述方法包括：i)在宿主细胞或无细胞表达系统中表达编码包含第一酶和第二酶的嵌合蛋白的多核苷酸；和ii)经由系链将辅因子附接至嵌合蛋白。在一个实例中，所述第一酶和所述第二酶通过接头分隔，并且步骤ii)包括将所述系链共价附接至所述接头。在一个实例中，嵌合蛋白还可包含上面例举的缀合模块蛋白。在一个实例中，该方法还包括将酶复合物缀合至固体支撑物。宿主细胞可以是任何细胞类型。实例包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或动物细胞。本专利技术的酶复合物可用于多种工业和非工业系统中，用于生产目标产品，其中合成需要可再循环的辅因子。本专利技术的酶复合物再循环辅因子的能力降低了与进行这些类型的反应相关的成本和工作负荷。因此，在另一方面，本专利技术提供了用于产生产物的方法，所述方法包括：i)提供根据本公开的酶复合物和第一酶的底物，以及ii)在足以使第一酶将底物转化成产物和足以使第二酶再循环辅因子以供第一酶使用的条件下，孵育酶复合物和底物一定时间。所述产物可以适用于商业销售，或为合成所需最终产物所需的中间产物。在一个实例中，该方法可包括两个或更多个酶促步骤，并且可使用本公开的两种不同的酶复合物进行所述酶促步骤中的至少两个步骤。在一个实例中，所述方法在生物反应器中进行。在一个实例中，生物反应器是连续流动生物反应器。在一个实例中，本公开涉及包含本公开内容的酶复合物的生物反应器。在另一方面，本专利技术提供了包含至少一种本专利技术的酶复合物的组合物。此类组合物可包含合适的载体和/或赋形剂。此类组合物可适合用于本专利技术的用于产生产物的方法。除非另有特别说明，否则本文的任何实施方案应被视为加以必要的变更地适用于任何其他实施方案。本专利技术在范围上不受本文所述的具体实施方案的限制，所述实施方案旨在仅仅为了举例说明的目的。如本文所述，功能上等同的产品、组合物和方法显然在本专利技术的范围内。在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另外要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组的提及应当被认为包括那些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组中的一个或多个(即，一种或多种)。在下文中通过以下非限制性实施例并参考附图来描述本专利技术。附图简述图1.双酶促融合蛋白TkGlpK:MsAK；BiF1(a)和EcG3PD::CaNOX；BiF2(b)的表达和纯化。图2.利用BiF1和BiF2的组合分批反应：将甘油转化成DHAP。图3.利用BiF1和BiF2的大规模组合双酶促分批反应的pH(a)和总产量(b)的作用。在室温下以1mL总体积利用100mM甘油、各500μM的ATP和NAD、100mM乙酰磷酸和400μg/mL(～4μM)的每种双酶促融合蛋白进行反应。图4.A.使用三种不同的醛受体将甘油经由DHAP转化成糖和糖类似物的多酶反应方案。B.使用BiF1、BiF2和来自肉葡萄球菌I(S.carnosusI)(ScFruA)和嗜钙栖热菌(T.caldophilus)(TcFruA)的醛缩酶将甘油转化成甘油-3-磷酸、DHAP和手性糖的多酶分批反应。图5.用于将甘油转化成果糖-1,6-二磷酸的多酶分批反应的pH的优化。误差棒显示平均值本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的酶复合物，所述酶复合物包含：a)辅因子，b)需要所述辅因子进行酶促反应的第一酶，和c)使所述辅因子再循环的第二酶，其中所述第一酶、第二酶和辅因子通过共价附接形成所述酶复合物，并且其中所述辅因子经由系链共价附接，所述系链允许所述辅因子被所述第一酶使用并被所述第二酶再循环。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.20 AU 2015902880;2015.07.24 AU 20159029611.一种分离的酶复合物，所述酶复合物包含：a)辅因子，b)需要所述辅因子进行酶促反应的第一酶，和c)使所述辅因子再循环的第二酶，其中所述第一酶、第二酶和辅因子通过共价附接形成所述酶复合物，并且其中所述辅因子经由系链共价附接，所述系链允许所述辅因子被所述第一酶使用并被所述第二酶再循环。2.如权利要求1所述的酶复合物，其中所述辅因子选自由ATP/ADP、NAD+/NADH、NADP+/NADPH和FAD+/FADH2组成的组。3.如权利要求1或权利要求2所述的酶复合物，其中所述辅因子具有核糖核苷酸核心。4.如权利要求2或权利要求3所述的酶复合物，其中所述系链经由至所述核糖核苷酸核心的碱基部分的C-N键共价附接至所述核糖核苷酸核心。5.根据权利要求1至3中任一项所述的酶复合物，其中所述系链包括聚乙二醇(PEG)链、烃链、多肽、多核苷酸。6.如权利要求5所述的酶复合物，其中所述聚乙二醇链的长度为PEG2–PEG48(即(-CH2CH2O-)2至(-CH2CH2O-)48)。7.如权利要求5所述的酶复合物，其中所述烃链的长度为C12–C18。8.根据权利要求1至7中任一项所述的酶复合物，其中所述辅因子被栓系至所述酶之一。9.根据权利要求1至8中任一项所述的酶复合物，其中所述第一和第二酶通过接头共价附接。10.如权利要求9所述的酶复合物，其中所述辅因子被栓系至所述接头。11.如权利要求9或权利要求10所述的酶复合物，其中所述接头是氨基酸接头。12.如权利要求11所述的酶复合物，其中所述接头包含Cys、Thr、Glu或Lys氨基酸残基。13.如权利要求11或权利要求12所述的酶复合物，其中所述接头包含GlySerSer氨基酸残基重复序列(GlySerSer)n。14.如权利要求13所述的酶复合物，其中所述接头包含(GlySerSer)3Cys(GlySerSer)3。15.根据权利要求1至14中任一项所述的酶复合物，其中所述第一酶选自由以下组成的组：i)激酶；ii)脱氢酶；iii)加氧酶；iv)醛缩酶；v)还原酶；vi)合酶。16.根据权利要求1至15中任一项所述的酶复合物，其中所述第二酶选自由以下组成的组：i)激酶；ii)脱氢酶；iii)氧化酶；iv)还原酶；v)过氧化物酶。17.根据权利要求1至16中任一项所述的酶复合物，其中所述复合物包含：i)鹿儿岛热球菌甘油激酶、耻垢分枝杆菌ATP激酶、ATP/ADP；ii)大肠埃希氏菌甘油-3-磷酸脱氢酶、ClostridiumaminoverlaricumNADH氧化酶、NAD/NADH；iii)希瓦氏菌属黄酶、嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶、NAD/NADH；iv)嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶、博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶、NADP/NADPH；或v)枯草芽孢杆菌黄酶、博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶、NADP/NADPH。18.根据权利要求1至17中任一项所述的酶复合物，其还包含用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·斯科特，C·哈特利，C·威廉斯，Q·邱凯萨，J·朔布莱，N·蒂内尔，N·弗伦克，
申请(专利权)人：联邦科学技术研究组织，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU