在高温下表达和分泌异源蛋白的酵母菌株制造技术

技术编号:18464261 阅读:22 留言:0更新日期:2018-07-18 15:07
本公开涉及能够维持在高温下的稳健性的重组酵母菌株以及由所述重组酵母菌株表达的重组蛋白。本公开还提供使用所述重组酵母菌株制备发酵产物的方法。本公开进一步提供一种用于制备能够维持在高温下的稳健性的重组酵母菌株的方法。

Yeast strains expressing and secreting heterologous proteins at elevated temperatures

The present disclosure relates to a robust recombinant yeast strain capable of maintaining a high temperature and a recombinant protein expressed by the recombinant yeast strain. The disclosure also provides a method for preparing fermentation products using the recombinant yeast strain. The disclosure further provides a method for preparing a robust recombinant yeast strain capable of maintaining a high temperature.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在高温下表达和分泌异源蛋白的酵母菌株相关申请和文献的交叉引用本申请要求2015年9月4日提交的美国临时专利申请序列号62/214,412和2016年2月25日提交的62/299,897的优先权,这两者在此整体引入。本申请与电子形式的序列表一同提交。所述序列表的内容在此整体并入。
本公开涉及维持高温稳健性的重组酵母用于表达和分泌异源蛋白的用途。本公开还涉及所述重组酵母和/或其表达的异源蛋白用于水解底物(例如像木质纤维素生物质)的用途。
技术介绍
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是燃料乙醇的商业生产中使用的主要生物催化剂。此生物体擅长将葡萄糖发酵成乙醇,常常至大于20%w/v的浓度。然而,天然酿酒酵母缺乏水解多糖的内在能力,且因此需要外源性添加酶(当使用玉米时,例如像α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶)以便将复合糖转化为葡萄糖。使用能够表达功能性葡萄糖淀粉酶的经遗传修饰的酿酒酵母(例如像WO2011153516中所述的那些)意在降低酶的总成本。然而,异源蛋白在酿酒酵母中的过度表达可引起若干应激反应,这可对生物体的总体发酵性能产生显著影响。与发酵过程已有的高应激(即,高乙醇、温度、渗透压、pH应激)结合,任何代谢干扰都可对宿主产生有害的生理限制(Gassser等人,2008;Mattanovich等人,2004)。酵母的一般发酵稳健性的任何下降都可引起有害的加工干扰,如发酵停滞、可造成污染的动力学降低、乙醇滴定度降低、或带来许多下游加工问题的高残余糖分。由于酵母是兼性厌氧菌,所以代谢状态也可影响蛋白质表达,如发酵期间异源蛋白的定时表达可以影响适当的功能并且影响转录/翻译应激。已在重组蛋白的分泌方面进行了许多改进,不管是靶向发酵过程的优化、宿主分泌途径的代谢工程改造、或异源蛋白的蛋白质工程改造,以符合天然酵母过程(Idiris等人,2010;Martinez等人,2012)。已显示在异源蛋白的N末端区域中的糖基化位点的定向工程改造通过阻止多肽的暴露的疏水性残基在ER中的聚集来改善分泌(Sagt等人,2000)。尽管在改善分泌方面的所有这些进展,但对特别是在燃料乙醇的高浓度发酵期间恢复或维持细胞应激耐受性仍然存在技术挑战。非常需要提供一种重组酵母菌株,其能够减轻重组蛋白生产和分泌对生长速率、特别是高温生长速率的影响。还非常需要提供制造和使用此类重组酵母菌株的方法。
技术实现思路
本公开涉及一种异源核酸分子,其能够恢复或提高表达异源蛋白的重组酵母宿主细胞的高温稳健性。所述异源核酸分子可包括使用一个或多个厌氧调节性启动子来表达异源蛋白和/或对异源蛋白的氨基酸序列和/或糖基化模式进行修饰。在第一方面,本公开涉及一种包含异源核酸分子的重组酵母宿主细胞,所述异源核酸分子具有可操作地连接至编码第一异源蛋白的第一核酸分子的第一启动子。在所述重组酵母宿主细胞中,第一启动子可基于以下来选择:当与重组酵母宿主细胞置于需氧条件下获得的第一异源蛋白的表达水平相比时,当重组酵母宿主细胞处于至少部分厌氧条件下时所述第一启动子能够增加(例如能够增加)第一异源蛋白的表达。作为替代或补充,在重组酵母宿主细胞中,第一异源蛋白可包含至少一个氨基酸取代(当与相应的第一天然异源蛋白相比时),这恢复、维持或提高了重组酵母宿主细胞在高温下的稳健性。在一个实施方案中,异源核酸分子还包含第二启动子,当重组酵母宿主细胞处于至少部分厌氧条件下时所述第二启动子能够增加第一异源蛋白的表达,并且其中第二启动子可操作地连接至第一核酸分子。在这样的实施方案中,第一启动子和/或第二启动子可选自由以下组成的组:tdh1p、pau5p、hor7p、adh1p、tdh2p、tdh3p、gpd1p、cdc19p、eno2p、pdc1p、hxt3p及tpi1p。在又一个实施方案中,第一异源蛋白与相应的第一天然异源蛋白相比包含引入(推定的)糖基化位点的第一氨基酸取代。在一些实施方案中,第一氨基酸取代可位于第一异源蛋白的N末端区域中。在又一个实施方案中,第一氨基酸取代可在第一异源蛋白中引入天冬酰胺残基作为(推定的)糖基化位点。在再一个实施方案中,第一异源蛋白是裂解酶,例如像糖解酶(例如,葡萄糖淀粉酶或α-淀粉酶)。在其中第一异源蛋白是葡萄糖淀粉酶的实施方案中,相应的第一天然蛋白可具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。在这样的实施方案中,第一异源蛋白可具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的氨基酸序列。在又一个实施方案中,第一异源蛋白不具有M6423的氨基酸序列。在其中第一异源蛋白是α-淀粉酶的实施方案中,相应的第一天然蛋白可具有SEQIDNO:6的氨基酸序列。在这样的实施方案中,第一异源蛋白可具有SEQIDNO:7的氨基酸序列。在再一个实施方案中,重组酵母宿主细胞(其可为酿酒酵母)包含至少两个厌氧调节性启动子(pau5p和tdh1p)并且编码具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的异源蛋白。在一些实施方案中,重组酵母宿主细胞可来自于酵母属(例如来自酿酒酵母种)。在其它实施方案中,重组酵母宿主细胞可来自于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Arxula属、德巴利酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、法夫酵母属(Phaffia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)。根据第二方面,本公开提供一种分离的葡萄糖淀粉酶,其具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQID:4的氨基酸序列或其功能片段。在一个实施方案中,分离的葡萄糖淀粉酶不具有M6423的氨基酸序列。根据第三方面,本公开提供一种分离的α-淀粉酶,其具有SEQIDNO:7的氨基酸序列或其功能片段。根据第四方面,本公开提供一种重组核酸分子,其包含如本文所定义的第一启动子和如本文所定义的第一核酸分子。根据第五方面,本公开提供一种用于水解木质纤维素生物质的方法。概括地说,所述方法包括在允许底物被由重组酵母宿主细胞表达的第一异源蛋白、分离的葡萄糖淀粉酶和/或分离的α-淀粉酶裂解的条件下,将木质纤维素生物质与(i)本文所定义的重组酵母宿主细胞或(ii)本文所定义的分离的葡萄糖淀粉酶和/或本文所定义的分离的α-淀粉酶合并。在一个实施方案中,所述方法还包括:当将木质纤维素生物质与重组酵母宿主细胞合并时,(b)在允许由重组酵母宿主细胞生成发酵产物的条件下培养重组酵母宿主细胞。或者,在另一个实施方案中,所述方法还可包括:当木质纤维在重组酵母细胞不存在下合并时将底物与酵母细胞(例如,非遗传修饰的酵母细胞)合并及(b)在允许由酵母细胞生成发酵产物的条件下培养酵母细胞。在一个实施方案中,发酵产物是乙醇。在再一个实施方案中,木质纤维素生物质包括淀粉(其可例如以胶化形式或未加工形式(rawform)提供)。当淀粉以胶化形式提供时,第一异源蛋白和/或分离的葡萄糖淀粉酶可具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。当淀粉以未加工形式提供时,第一异源蛋白和/或葡萄糖淀粉酶可具有SEQIDNO:4的氨基酸序列本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种包含异源核酸分子的重组酵母宿主细胞,所述异源核酸分子具有可操作地连接至编码第一异源蛋白的第一核酸分子的第一启动子,其中:‑当与相应的第一天然异源蛋白相比时,所述第一异源蛋白包含至少一个氨基酸取代,所述氨基酸取代维持或提高了所述重组酵母宿主细胞在高温下的稳健性;和/或‑当与所述重组酵母宿主细胞置于至少部分需氧条件下获得的所述第一异源蛋白的表达水平相比时,当所述重组酵母宿主细胞处于至少部分厌氧条件下时,所述第一启动子能够增加所述第一异源蛋白的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.04 US 62/214,412;2016.02.25 US 62/299,8971.一种包含异源核酸分子的重组酵母宿主细胞,所述异源核酸分子具有可操作地连接至编码第一异源蛋白的第一核酸分子的第一启动子,其中:-当与相应的第一天然异源蛋白相比时,所述第一异源蛋白包含至少一个氨基酸取代,所述氨基酸取代维持或提高了所述重组酵母宿主细胞在高温下的稳健性;和/或-当与所述重组酵母宿主细胞置于至少部分需氧条件下获得的所述第一异源蛋白的表达水平相比时,当所述重组酵母宿主细胞处于至少部分厌氧条件下时,所述第一启动子能够增加所述第一异源蛋白的表达。2.如权利要求1所述的重组酵母宿主细胞,其中所述异源核酸分子还包含第二启动子,当所述重组酵母宿主细胞处于至少部分厌氧条件下时所述第二启动子能够增加所述第一异源蛋白的表达,并且其中所述第二启动子可操作地连接至所述第一核酸分子。3.如权利要求1或2所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一启动子和所述第二启动子选自由以下组成的组:tdh1p、pau5p、hor7p、adh1p、tdh2p、tdh3p、gpd1p、cdc19p、eno2p、pdc1p、hxt3p及tpi1p。4.如权利要求3所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一启动子和所述第二启动子是pau5p和tdh1p。5.如权利要求1至4中任一项所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一异源蛋白当与相应的第一天然异源蛋白相比时包含引入推定的糖基化位点的第一氨基酸取代。6.如权利要求5所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一氨基酸取代位于所述第一异源蛋白的N末端区域中。7.如权利要求5或6所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一氨基酸取代在所述第一异源蛋白中引入天冬酰胺残基作为所述推定的糖基化位点。8.如权利要求1至7中任一项所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一异源蛋白是裂解酶。9.如权利要求8所述的重组酵母宿主细胞,其中所述裂解酶是糖解酶。10.如权利要求9所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一异源蛋白是葡萄糖淀粉酶。11.如权利要求10所述的重组酵母宿主细胞,其中所述相应的第一天然蛋白具有SEQIDNO:1的氨基酸序列。12.如权利要求11所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一异源蛋白具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的氨基酸序列。13.如权利要求9所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一异源蛋白是α-淀粉酶。14.如权利要求13所述的重组酵母宿主细胞,其中所述相应的第一天然蛋白具有SEQIDNO:6的氨基酸序列。15.如权利要求14所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一异源蛋白具有SEQIDNO:7的氨基酸序列。16.如权利要求1至15中任一项所述的重组酵母宿主细胞,其是来自于酵母属(genusSaccharomyces)。17.如权利要求16所述的重组酵母宿主细胞,其是来自于酿酒酵母种(speciesSaccharomycescerevisiae)。18.如权利要求1至15中任一项所述的重组酵母宿主细胞,其来自于酵母属(genusSaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Arxula属(Arxula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、法夫酵母属(Phaffia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)。19.如权利要求2所述的重组酵母宿主细胞,其中所述第一启动子和所述第二启动子由pau5p和tdh1p组成且其中所述第一异源蛋白具有SEQIDNO:4的氨基酸序列。20.一种分离的葡萄糖淀粉酶,其具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQID:4的氨基酸序列或其功能片段。21.一种分离的α-淀粉酶,其具有SEQIDNO:7的氨基酸序列或其功能片段。22.一种重组核酸分子,其包含...

【专利技术属性】
技术研发人员:查尔斯·F·赖斯瑞安·斯金纳特丽莎·巴雷特阿龙·阿吉罗斯
申请(专利权)人:拉勒曼德匈牙利流动性管理有限责任公司
类型:发明
国别省市:匈牙利,HU

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