悬浮培养驯化粘附型细胞的制备方法、粘附型上皮细胞的上皮间叶转化诱导方法及其利用技术

本发明专利技术为：驯化成悬浮培养的粘附型细胞的制备方法，其具有将粘附型细胞在与含脂环结构聚合物成型体接触的状态下进行培养的工序；由外来基因编码的核酸或蛋白质的生产方法，其基于以下方式进行，即通过该方法培养上述驯化成悬浮培养的粘附型细胞；由含脂环结构聚合物成型体形成的粘附型细胞的悬浮培养驯化促进剂；用于使粘附型细胞驯化成在液体培养基中悬浮培养的、含脂环结构聚合物成型体的使用；至少底面由含脂环结构聚合物成型体形成的粘附型细胞的悬浮培养驯化用容器；上皮间叶转化的诱导方法，其具有将粘附型上皮细胞在与含脂环结构聚合物成型体接触的状态下进行培养的工序；由外来基因编码的核酸或蛋白质的生产方法，其基于以下方式进行，即通过上述诱导方法培养经上皮间叶转化的粘附型细胞；等。

Preparation of acclimated adherent cells, induction of epithelial mesenchymal transition of adhesive epithelial cells and their utilization

The invention is a preparation method of acclimated into a suspension culture of adherent cells, which has a process of cultivating adherent cells in contact with a lipoprotein forming polymer forming body; a production method of nucleic acid or protein encoded by an alien gene is based on the following method, that is, it is cultivated by this method. An adhesion type cell domesticated into a suspension culture; a suspension culture acclimation promoter formed by a liporing structure polymer forming body; used to domesticate adherent cells into a suspension culture in liquid medium and use a liporing structure polymer forming body; at least the bottom surface is composed of a fat containing ring structure polymer. A container for the suspension culture and acclimatization of a type of adherent cells formed by a type of type; an induction method for epithelial leaf transformation; it has the process of cultivating adherent epithelial cells in contact with a lipoprotein forming polymer forming body; the production method of nucleic acids or proteins encoded by foreign genes is based on the following methods Then, through the induction method, the adhesive cells transformed by epithelial mesenchymal cells were cultured.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】悬浮培养驯化粘附型细胞的制备方法、粘附型上皮细胞的上皮间叶转化诱导方法及其利用
本专利技术涉及驯化成悬浮培养的粘附型细胞的制备方法。此外，本专利技术涉及粘附型上皮细胞的上皮间叶转化的诱导方法。
技术介绍
近年来，代替由低分子化合物形成的医药品，副作用少的生物医药品的研究盛行。生物医药品为通过基因重组技术所制造的重组医药品。例如，作为重组医药品，已知将用于癌治疗、风湿治疗的抗体、作为用于增加红血球的激素的促红细胞生成素(EPO)等蛋白质作为成分的重组医药品。然而，重组医药品有时用于治疗的给药量多且用于生产的费用高，还没有充分普及。因此，提高生产率成为一个问题。重组医药品可通过例如下述方法生产：以在CHO(中国仓鼠的卵巢；ChineseHamsterOvary)细胞等粘附型细胞中导入目标蛋白质的基因、在悬浮状态下进行增殖的方式，制备重组CHO细胞，在该重组CHO细胞内使目标蛋白质生物合成。通常，细胞在悬浮培养系统中粘附型细胞的平均倍增时间变迟。因此，为了提高增殖能力需要驯化成适于悬浮培养环境的操作。作为使粘附型细胞驯化成悬浮培养的方法，例如专利文献1中记载了下述方法：通过将编码目标蛋白质的基因和具有二氢叶酸还原酶基因的质粒向CHO细胞中进行基因导入，将得到的重组CHO细胞在与通常相比细胞密度低的条件下反复进行培养，从而将重组CHO细胞在悬浮状态下进行培养。然而，由于该方法为反复进行培养直到使CHO细胞成为悬浮状态的方法，因此需要8周左右的长时间。此外，当传代培养时间变长时，会增加对基因的变异、细胞的变质等状态进行管理、确认的劳力和时间以及费用。此外，专利文献2中记载了通过在二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞株中重组人抗凝血酶基因和二氢叶酸还原酶基因，使用中空纤维型培养装置培养成为了悬浮状态的重组CHO细胞，从而一边使该细胞悬浮一边制造人抗凝血酶的方法。然而，在该方法中，由于安装有中空纤维的装置复杂且价格昂贵，因此有费用方面的问题。此外，当为了大量培养而使中空纤维的尺寸变大时，在中空纤维两端的培养基交换不均等，培养基容易变得不均匀。结果，由于培养基的pH等发生变化、中空纤维内的细胞受到压力，因此目标蛋白质的生产率可能降低。此外，上皮间叶转化(Epithelial-MesenchymalTransition(Transformation)；EMT)为在发育、创伤治愈以及癌的浸润、转移等生命现象中所观察到的上皮细胞的性质转化为间叶细胞的性质的过程。通过上皮间叶转化从而细胞表达的某种蛋白质发生变化。将这样的蛋白质称为上皮间叶转化标记，基于上皮间叶转化的诱导从而存在表达量增加的上皮间叶转化标记(上调，upregulation)和表达量减少的上皮间叶转化标记(下调，downregulation)。例如，作为表达量增加的上皮间叶转化标记，已知N-钙粘蛋白、波形蛋白，作为表达量减少的上皮间叶转化标记，已知E-钙粘蛋白、细胞角蛋白(专利文献3)。此外，由于上皮间叶转化会被TGF等生长因子诱导，因此TGF等生长因子作为上皮间叶转化诱导因子而为人所知(非专利文献1)。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开平2-009388号公报；专利文献2：日本特开2005-073509号公报；专利文献3：WO2006/101925号单行本。非专利文献非专利文献1：MassagueJ,Cell,2008年7月，134卷，2号，215-230页。
技术实现思路
专利技术要解决的问题如上所述，虽然此前提出了若干使粘附型细胞驯化成悬浮培养的技术，但现状期望可以更高效且更廉价地驯化的方法。本专利技术是鉴于这样的实际情况而完成的，目的在于提供：驯化成悬浮培养的粘附型细胞的制备方法，该方法不需要对粘附型细胞进行特殊的操作，在悬浮状态下也不会死亡；使用了以该方法制备的驯化成悬浮培养的粘附型细胞的、核酸或蛋白质的生产方法；由含脂环结构聚合物成型体形成的粘附型细胞的悬浮培养驯化促进剂；用于使粘附型细胞驯化成悬浮培养的含脂环结构聚合物成型体的使用；以及粘附型细胞的悬浮培养驯化用容器。此外，本专利技术的目的在于提供：仅以使粘附型上皮细胞接触的操作而诱导上皮间叶转化的方法；使用了以该方法被上皮间叶转化了的细胞的核酸或蛋白质的生产方法；由含脂环结构聚合物成型体形成的粘附型上皮细胞的上皮间叶转化诱导剂；用于对粘附型上皮细胞进行上皮间叶转化诱导的含脂环结构聚合物成型体的使用；以及粘附型上皮细胞的上皮间叶转化诱导用容器。用于解决问题的方案本专利技术人为了解决上述问题进行了深入的研究，结果发现，通过使粘附型培养细胞以与含脂环结构聚合物成型体接触的状态进行培养，从而能够使原本需要作为支架的细胞外基质的粘附型细胞在悬浮培养系统中增殖，即能够驯化粘附型细胞，从而完成了涉及粘附型细胞的悬浮驯化的本专利技术。进而，本专利技术人等发现该细胞通过与含脂环结构聚合物成型体接触而可转化为间叶系细胞那样的性质，以至完成了涉及粘附型上皮细胞的上皮间叶转化诱导的本专利技术。由此，根据本专利技术可提供：(1)～(5)的粘附型细胞的制备方法，(6)、(15)的由外来基因编码的核酸或蛋白质的生产方法，(7)的粘附型细胞的悬浮培养驯化促进剂，(8)、(17)的含脂环结构聚合物成型体的使用，(9)、(10)的悬浮培养驯化用容器，(11)～(14)的上皮间叶转化的诱导方法，(16)的粘附型上皮细胞的上皮间叶转化诱导剂，(18)、(19)的粘附型上皮细胞的上皮间叶转化诱导用容器。(1)一种驯化成悬浮培养的粘附型细胞的制备方法，具有将粘附型细胞在与含脂环结构聚合物成型体接触的状态下进行培养的工序。(2)根据(1)所述的粘附型细胞的制备方法，其中，上述粘附型细胞为表达外来基因的经基因重组的粘附型细胞。(3)根据(2)所述的粘附型细胞的制备方法，其中，上述外来基因为编码蛋白质的基因。(4)根据(1)～(3)中任一项所述的粘附型细胞的制备方法，其中，上述粘附型细胞为来自动物的细胞。(5)根据(4)所述的粘附型细胞的制备方法，其中，上述来自动物的细胞为CHO细胞。(6)一种由外来基因编码的核酸或蛋白质的生产方法，基于以下方式进行：通过上述(1)～(5)中任一项所述的粘附型细胞的制备方法而培养上述驯化成悬浮培养的粘附型细胞。(7)一种悬浮培养驯化促进剂，由含脂环结构聚合物成型体形成。(8)一种含脂环结构聚合物成型体的使用，用于使粘附型细胞驯化成在液体培养基中悬浮培养。(9)一种粘附型细胞的悬浮培养驯化用容器，至少底面由含脂环结构聚合物成型体形成。(10)根据(9)所述的悬浮培养驯化用容器，其中，上述含脂环结构聚合物为饱和降冰片烯系聚合物。(11)一种上皮间叶转化的诱导方法，具有将粘附型上皮细胞在与含脂环结构聚合物成型体接触的状态下进行培养的工序。(12)根据(11)所述的上皮间叶转化的诱导方法，其中，上述粘附型上皮细胞为表达外来基因的经基因重组的粘附型细胞。(13)根据(11)或(12)所述的上皮间叶转化的诱导方法，其中，上述粘附型上皮细胞为来自动物的细胞。(14)根据(13)所述的上皮间叶转化的诱导方法，其中，上述来自动物的细胞为CHO细胞。(15)一种由外来基因编码的核酸或蛋白质的生产方法，基于以下方式进行：通过上述(12)～(14)中任一项所述的上皮间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种驯化成悬浮培养的粘附型细胞的制备方法，具有将粘附型细胞在与含脂环结构聚合物成型体接触的状态下进行培养的工序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.18 JP 2015-247270;2016.10.28 JP 2016-211701.一种驯化成悬浮培养的粘附型细胞的制备方法，具有将粘附型细胞在与含脂环结构聚合物成型体接触的状态下进行培养的工序。2.根据权利要求1所述的粘附型细胞的制备方法，其中，所述粘附型细胞为表达外来基因的经基因重组的粘附型细胞。3.根据权利要求2所述的粘附型细胞的制备方法，其中，所述外来基因为编码蛋白质的基因。4.根据权利要求1～3中任一项所述的粘附型细胞的制备方法，其中，所述粘附型细胞为来自动物的细胞。5.根据权利要求4所述的粘附型细胞的制备方法，其中，所述来自动物的细胞为CHO细胞。6.一种由外来基因编码的核酸或蛋白质的生产方法，基于以下方式进行：通过权利要求1～5中任一项所述的粘附型细胞的制备方法而培养所述驯化成悬浮培养的粘附型细胞。7.一种悬浮培养驯化促进剂，由含脂环结构聚合物成型体形成。8.一种含脂环结构聚合物成型体的使用，用于使粘附型细胞驯化成在液体培养基中悬浮培养。9.一种粘附型细胞的悬浮培养驯化用容器，至少底面由含脂环...

【专利技术属性】
技术研发人员：平野孝明，三村由美子，
申请(专利权)人：日本瑞翁株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP