用于适应的方法技术

本发明专利技术总体涉及细菌的生长。更具体地，本发明专利技术涉及厌氧微生物的氧化环境适应的方法及其在开发新的益生菌中的用途。具体而言，本发明专利技术提供了用于使厌氧微生物适应和选择更耐氧的厌氧微生物的方法，所述方法包括用经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和为了调节氧化还原状态的抗氧化剂/氧化的配对物浓度比的逐步改变来培养所述微生物的步骤。还提供了新的菌株。

A method of adaptation

The invention generally relates to the growth of bacteria. More specifically, the present invention relates to the adaptation of anaerobic microorganisms to oxidative environment and its use in the development of new probiotics. In particular, the present invention provides a method for adapting and selecting anaerobic microorganisms to adapt and select more oxygen resistant microorganisms. The method includes a gradual double induction of oxidation stress by applying voltage and oxygen diffusion, and a gradual change in the concentration ratio of antioxidants / oxidants to regulate the redox state. The steps of the microorganism. New strains are also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于适应的方法专利
本专利技术总体涉及细菌的生长。更具体地，本专利技术涉及厌氧微生物的氧化环境适应的方法及其在开发新的益生菌中的用途。还提供了通过本专利技术的方法获得的新(经适应的)菌株。专利技术背景成人肠道微生物群由最多达100万亿个微生物(等于我们体细胞和生殖细胞总数的十倍)组成。我们的肠道微生物(微生物组)的宏基因组(collectivegenomes)可以含有是我们自己的基因组的150倍以上的基因，并且为我们赋予不需要凭我们自身进化得到的生理能力。然而，这些群落在很大程度上仍未被研究，几乎完全不知道它们对人类发育、生理、免疫、营养和健康的影响。微生物群落具有巨大的影响宿主生物学的能力，并且除了是维生素和激素产生等的来源之外，对于我们的免疫系统的发育、处理以其他方式不易消化的膳食多糖的能力是重要的。大肠中的微生物群落在调节肠道健康和几种疾病的发病机制中具有至关重要的作用。传统的微生物学已经集中于将个别物种作为分离的单位进行研究。然而，许多（如果不是大部分）从未成功被分离为活样本用于分析，这据推测是因为它们的生长依赖于未经实验再现的特定微环境。DNA测序技术的进展已经创造了一个新的研究领域，称为宏基因组学，其允许全面检查微生物群落，甚至是由不可培养的生物体构成的那些。宏基因组学方法允许分析源自从自然环境中收获的完整微生物群落的遗传物质，而不是检查已在实验室中生长的个别细菌菌株的基因组。人类肠道微生物组充当有益微生物、潜在益生菌的资源。尽管在疾病诸如炎性肠病、心血管疾病、糖尿病和自闭症谱系病症中预防和促进肠道微生物群的作用，但如几种宏基因组学研究表明，没有可用的治疗含有新型益生菌或所谓的下一代益生菌。即使成功分离，许多从肠道分离的微生物也需要严格的厌氧条件用于生长，并且当暴露于环境空气时不能存活超过几分钟。这使得开发稳定和稳健的益生菌制剂是有挑战的。因此需要更耐氧的厌氧微生物，并且本专利技术提供了使厌氧微生物适应的方法，以及已使用此类方法获得的新微生物菌株。专利技术概述本专利技术提供了用于使厌氧微生物适应氧化环境、因此实现此类生物体当暴露于环境空气时相对更耐氧的方法。这具有实现微生物的改善的培养和储存(例如，更长期储存)的进一步优点。本文提供了模拟的人肠道氧化还原模型(SHIRM)，其中进行经由施加电压和氧扩散来逐步双重诱导氧化应激和为了调节氧化还原状态而逐步改变抗氧化剂/氧化的对应物浓度比。氧对于厌氧微生物是致命的，因此用于氧化应激的溶解氧(氧浓度)将增加，但保持在亚致死浓度，而使用抗氧化剂/氧化的对应物对来调节环境的氧化还原状态。还经由施加电压诱导氧化应激。氧化应激增加细菌对氧化环境的耐受性，并使得可以使微生物在环境空气中存活相对更长的时间段。可以容易地确定适当的亚致死氧浓度(不导致杀死存在的所有细菌的浓度，或者换言之，其中一些、但不是所有细菌被杀死的浓度)，例如，使得至少一些(但通常不是所有)细菌可以存活，然后可以选择用于该方法中的下一步骤。然后使存活的细菌再次生长，例如用氧化应激的增加(例如通过增加溶解氧浓度)，使得再次至少一些(但通常不是所有)细菌可以存活并且然后可以选择用于该方法中的下一步骤。然后可以根据需要或期望多次再重复增加氧化应激的这一步骤以获得更耐氧的微生物。本专利技术提供了用于使厌氧微生物适应和选择更耐氧的厌氧微生物的方法，所述方法包括以下步骤：用经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和氧化还原状态的逐步改变来培养所述微生物，其中优选地使用调节氧化还原状态的抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的逐步改变来进行氧化还原状态的逐步改变。本专利技术提供了用于使厌氧微生物适应(或训练厌氧微生物)和选择更耐氧(例如相对更耐氧)的厌氧微生物的方法，其中用经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和为了调节氧化还原状态的抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的逐步改变的组合来培养所述微生物。本专利技术进一步提供了用于增强产生厌氧微生物的方法，其中用恒定氧化电位/施加电压、氧扩散和抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的组合来培养所述微生物，因此实现选择压力并产生高产量的某些微生物菌株。所述培养处于最佳设定(setting)，或者换言之，恒定氧化电位/施加电压、氧扩散和抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的组合已经被优化用于产生厌氧微生物。附图描述图1显示人体肠腔的氧化还原池(pool)。尽管存在经由摄入食物和从肠粘膜扩散的氧气的持续流入的事实，但肠道的净氧化还原电位仍然为负值，约为-300mV。图2显示由氧化应激引起的对氧敏感酶的潜在损害和恢复机制。图3显示人类肠道中的肠道微生物群采用的主要发酵途径。图4a定制的3室的模拟的人肠道氧化还原模型(SHIRM)。图4bSHIRM中从细菌细胞朝向电子受体的电子流的示意图。以(Eo')伏特测量的氧化还原电位(还原电位和氧化电位)。图4c参与从细菌细胞至电子受体的电子转移的中间体(包括氧化还原电位)的SHIRM示意图。图5SHIRM操作的基本工作流程。图6与小床体积约100ml供氧器耦合的SHIRM阳极室的代表。图7空气呼吸SHIRM：经由侧臂从空气进入阳极室的直接氧扩散。图8SHIRM操作的工作流程，10个步骤图9经适应的菌株的选择图10探索经适应的菌株的耐氧性的策略。本专利技术的详述及其优选实施方案定义“适应”是一个动态的进化过程，例如自然选择的结果，由此生物体变得更好地能够生活在其一种或多种栖息地中。微生物的适应(或训练)过程也可以有利地在非天然/人工/体外环境中进行，诸如在本专利技术的方法中。“抗氧化剂”是通过清除自由基或通过修复或除去受损分子防止形成活性氧、氮、羟基和脂质物质的试剂。抗氧化剂通常可以直接充当还原剂。“还原剂”是在氧化还原化学反应中失去(或“供给”)电子给另一种试剂的物质、元素或化合物。由于还原剂正在失去电子，称它已被氧化。“氧化的对应物”是引起从另一物质中除去电子的化学物质。氧化的对应物是抗氧化剂的氧化形式。“氧化还原介体”或电子穿梭物是可以经历可逆的氧化还原反应并促进电子转移/穿梭进出细菌的化合物。“施加电压”、“外部电压”、“氧化电位”、“施加的电氧化电位”、“施加的电极电位”、“电压”和“电位电压”可以互换使用并且是指施加至生物反应器中的室的电压。“氧扩散”是氧分子从高浓度至低浓度的运动。“氧流量”是每单位时间递送至室(例如，含有微生物的阳极室)中的氧气量。肠道微生物群与膳食氧化还原活性化合物和电子供体诸如碳水化合物和蛋白质一起在维持肠道中的还原环境中发挥作用。这意味着肠道微生物群适合于处理肠腔内的溶解氧流入(图1)。高浓度的溶解氧对大量肠道微生物是致命的，并且还原环境有助于从氧化损伤中恢复(图2)。更详细地，图3显示人类肠道中的肠道微生物群采用的主要发酵途径。混合的酸发酵和气体产生平衡了厌氧生长期间的电子失衡。一些微生物将电子呼吸至细胞外电子受体，诸如硝酸盐、硫酸盐或不溶性金属络合物。此外，氧气可以充当间接电子受体，因为一些肠道微生物可以消耗少量的氧气。氧化还原活性化合物诸如没食子酸盐、芦丁、白藜芦醇、咖啡因和黄素存在于常见饮食中，可能在消化道中被氧化，也可以充当电子受体(图1)。肠道的氧化还原状态可以影响某些药物或代谢物的生物利用度。尽管存在经由摄入食物和从肠粘膜扩散的氧气本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于使厌氧微生物适应和选择更耐氧的厌氧微生物的方法，所述方法包括用经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和为了调节氧化还原状态的抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的逐步改变来培养所述微生物的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.28 GB 1519087.91.用于使厌氧微生物适应和选择更耐氧的厌氧微生物的方法，所述方法包括用经由施加电压和氧扩散的氧化应激的逐步双重诱导和为了调节氧化还原状态的抗氧化剂/氧化的对应物浓度比的逐步改变来培养所述微生物的步骤。2.权利要求1的方法，其中所述抗氧化剂/氧化的对应物选自半胱氨酸/胱氨酸、谷胱甘肽/谷胱甘肽-氧化态、抗坏血酸/脱氢抗坏血酸、二硫苏糖醇/氧化的二硫苏糖醇和没食子酸/氧化的没食子酸。3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法包括抗氧化剂浓度的逐步降低组合氧化的对应物浓度的逐步增加，施加电压的逐步增加和氧流量的逐步增加。4.权利要求1至3中任一项的方法，其中用于所述方法的起始条件选自以下中的一种或多种或全部：低或零氧流量、低施加电压、高浓度的抗氧化剂和低浓度或零浓度的氧化的对应物、以及已经除去氧的培养基。5.权利要求4的方法，其中所述起始条件选自以下中的一种或多种或全部：8mM半胱氨酸、0mM胱氨酸、0.1V的施加电压和零或低氧流量。6.权利要求5的方法，其中持续逐步改变，直至以下中的一种或多种或全部：3mM的最小半胱氨酸浓度、5mM的最大胱氨酸浓度、0.6V的最大施加电压、以及高氧流量。7.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述施加电压不超过0.6V，和/或半胱氨酸浓度不低于3mM，和/或胱氨酸浓度不高于5mM，和/或培养基中的溶解氧浓度维持在亚致死浓度。8.权利要求1至7中任一项的方法，其中一旦已经...

【专利技术属性】
技术研发人员：MT克汉，F巴克赫德，
申请(专利权)人：麦太宝根有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE