丙型肝炎病毒E1/E2异二聚体及其生产方法技术

本公开提供了包含丙型肝炎病毒(HCV)E1多肽和HCV E2多肽的经亲和标记的异二聚体多肽，其中E1多肽和E2多肽中的一者或两者包含亲和标记。本公开提供了生产本公开的经亲和标记的E1/E2异二聚体的方法。本公开提供了生产未经标记的HCV E1/E2异二聚体的方法。本公开提供了HCV E1/E2异二聚体，包含HCV E1/E2异二聚体的组合物以及诱导对HCV的免疫应答的方法。

Hepatitis C virus E1/E2 two dimer and its production method

The present disclosure provides an affinity labeled isooligomeric polypeptide containing HCV E1 polypeptide and HCV E2 polypeptide, in which one or both E1 polypeptide and E2 polypeptide contains affinity markers. The present disclosure provides a method for producing affinity labelled E1/E2 two dimers in this disclosure. The present disclosure provides a method for producing unlabeled HCV E1/E2 isomer two. The present disclosure provides a HCV E1/E2 two mer, a composition comprising a HCV E1/E2 isomer, and a method of inducing an immune response to HCV.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】丙型肝炎病毒E1/E2异二聚体及其生产方法交叉引用本申请要求2015年10月8日提交的美国临时专利申请No.62/239,157和2016年5月16日提交的美国临时专利申请No.62/337,212的权益，所述申请通过引用整体并入本文。引言丙型肝炎病毒(HCV)是一种血液传播的病原体，估计其在全世界感染1.5亿至两亿人。HCV感染可能无症状，并且可以由患者清除，有时无需医疗干预。然而，大多数患者发生慢性HCV感染，其可能导致肝脏炎症、瘢痕形成、甚至导致肝功能衰竭或肝癌。仅在美国，就有超过300万人患有慢性感染。HCV病毒体含有约9.5kb的正义单链RNA基因组。该基因组编码3,010至3,030个氨基酸的单一多蛋白。结构蛋白包含形成病毒核衣壳的核心蛋白和两种包膜糖蛋白E1和E2。本领域需要用于诱导针对HCV的免疫应答的组合物和方法。概述本公开提供了使用亲和纯化标记(affinitypurificationtag)，例如与E2的N-末端融合的免疫球蛋白(人或来自其他物种)的人片段可结晶区(Fc区)，来促进丙型肝炎病毒(HCV)E1E2糖蛋白异二聚体的大规模纯化的方法。在E1E2异二聚体复合物的亲和纯化(例如，使用蛋白A或蛋白G或蛋白L亲和柱)后，可以通过用合适的蛋白酶在位于Fc结构域下游的蛋白水解切割位点消化来从E1E2复合物中移除Fc结构域。通常，E1E2的大规模纯化具有挑战性，限制了其作为人HCV疫苗的用途。本公开解决了这个挑战。本公开还提供包含HCVE1多肽和HCVE2多肽的多种经亲和纯化标记的异二聚体多肽，其中E1多肽和E2多肽中的一者或两者包含亲和纯化标记。本公开提供了生产本公开的经亲和标记的E1/E2异二聚体的方法。本公开提供了生产未经标记的HCVE1/E2异二聚体的方法。本公开还提供了HCVE1/E2异二聚体，包含HCVE1/E2异二聚体的组合物，以及诱导对HCV的免疫应答的方法；其中HCVE1/E2异二聚体包含变体HCVE1多肽或变体HCVE2多肽，变体E1或E2多肽包含来自蛋白水解可切割接头的1至6个氨基酸。本公开提供了经亲和标记的异二聚体多肽，其包含：a)丙型肝炎病毒(HCV)E1多肽；和b)HCVE2多肽，其中HCVE1和HCVE2多肽中的至少一个是包含亲和标记多肽的融合多肽。在一些情况下，经亲和标记的异二聚体多肽包含插入在亲和标记多肽与HCVE1或HCVE2多肽之间的蛋白水解可切割接头。在一些情况下，a)蛋白水解可切割接头包含序列LEVLFQGP(SEQIDNO:1)，其中切割在谷氨酰胺和甘氨酸之间进行；b)蛋白水解可切割接头包含序列ENLYFQS(SEQIDNO:2)，其中切割在谷氨酰胺和丝氨酸之间进行；c)蛋白水解可切割接头包含序列DDDDK(SEQIDNO:3)，其中切割紧邻赖氨酸残基的C-末端进行；或者d)蛋白水解可切割接头包含序列LVPR(SEQIDNO:4)(例如，其中蛋白水解可切割接头包含序列LVPRGS(SEQIDNO:5))。在一些情况下，亲和标记是免疫球蛋白(Ig)Fc多肽、蛋白A、蛋白G、杂合蛋白A-蛋白G多肽、蛋白L多肽、包含聚(组氨酸)段的多肽、免疫球蛋白轻链或谷胱甘肽-S-转移酶。在一些情况下，经亲和标记的异二聚体多肽包含：a)包含HCVE1多肽和亲和标记多肽的HCVE1-亲和标记融合多肽；和b)HCVE2多肽。在一些情况下，经亲和标记的异二聚体多肽包含：a)包含HCVE1多肽和IgFc多肽的HCVE1-Fc融合多肽；和b)HCVE2多肽。在一些情况下，HCVE1-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)HCVE1多肽；和ii)IgFc多肽。在一些情况下，HCVE1-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)IgFc多肽；和ii)HCVE1多肽。在一些情况下，经亲和标记的异二聚体多肽包含：a)包含HCVE2多肽和亲和标记多肽的HCVE2-亲和标记融合多肽；和b)HCVE1多肽。在一些情况下，经亲和标记的异二聚体多肽包含：a)包含HCVE2多肽和IgFc多肽的HCVE2-Fc融合多肽；和b)HCVE1多肽。在一些情况下，HCVE2-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)HCVE2多肽；和ii)IgFc多肽。在一些情况下，HCVE2-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)IgFc多肽；和ii)HCVE2多肽。在一些情况下，经亲和标记的异二聚体多肽包含：a)包含HCVE1多肽和亲和标记多肽的HCVE1-亲和标记融合多肽；和b)包含HCVE2多肽和亲和标记多肽的HCVE2-亲和标记融合多肽。在一些情况下，经亲和标记的异二聚体多肽包含：a)包含HCVE1多肽和IgFc多肽的HCVE1-Fc融合多肽；和b)包含HCVE2多肽和IgFc多肽的HCVE2-Fc融合多肽。在一些情况下，a)HCVE1-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)HCVE1多肽；和ii)IgFc多肽；并且b)HCVE2-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)HCVE2多肽；和ii)IgFc多肽。在一些情况下：a)HCVE1-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)IgFc多肽；和ii)HCVE1多肽；并且b)HCVE2-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)IgFc多肽；和ii)HCVE2多肽。在一些情况下，HCVE2多肽包含与图1A-1C、图2A-2C、图3A-3C和图4A-4B中的一个所示的E2多肽具有至少20％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，HCVE1多肽包含与图1A-1C、图2A-2C、图3A-3C和图4A-4B所示的E1多肽具有至少20％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，IgFc多肽包含与图5A-5C所示的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，包含经亲和标记的HCVE2多肽的经亲和标记的异二聚体多肽，其中所述HCVE2-亲和标记融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)HCVE2多肽的N-末端的2至15个氨基酸；ii)亲和标记多肽，iii)蛋白水解可切割接头；和iv)HCVE2多肽。在一些情况下，HCVE2多肽的N-末端的2至15个氨基酸是选自QT、ET、HT、GT、TT、RH、NT、AY、VI和ST的二肽。在一些情况下：a)蛋白水解可切割接头包含序列LEVLFQGP(SEQIDNO:1)，其中切割在谷氨酰胺和甘氨酸之间进行；b)蛋白水解可切割接头包含序列ENLYFQS(SEQIDNO:2)，其中切割在谷氨酰胺和丝氨酸之间进行；c)蛋白水解可切割接头包含序列DDDDK(SEQIDNO:3)，其中切割紧邻赖氨酸残基的C-末端进行；或者d)蛋白水解可切割接头包含序列LVPR(SEQIDNO:4)(例如，其中蛋白水解可切割接头包含序列LVPRGS(SEQIDNO:5))。在一些情况下，HCVE2多肽和HCVE1多肽具有相同的基因型。在一些情况下，HCVE2多肽和HCVE1多肽具有不同的基因型。在一些情况下，HCVE2多肽具有基因型1、2、3或7。在一些情况下，HCVE1多肽具有基因型1、2、3或7。本公开提供了一种组合物，其包含：a)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经亲和标记的异二聚体多肽，其包含：a)丙型肝炎病毒(HCV)E1多肽；和b)HCV E2多肽，其中所述HCV E1多肽和所述HCV E2多肽中的至少一个是包含亲和标记多肽的融合多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.08 US 62/239,157;2016.05.16 US 62/337,2121.一种经亲和标记的异二聚体多肽，其包含：a)丙型肝炎病毒(HCV)E1多肽；和b)HCVE2多肽，其中所述HCVE1多肽和所述HCVE2多肽中的至少一个是包含亲和标记多肽的融合多肽。2.根据权利要求1所述的异二聚体多肽，其包含插入在所述亲和标记多肽与所述HCVE1多肽或所述HCVE2多肽之间的蛋白水解可切割接头。3.根据权利要求2所述的异二聚体多肽，其中：a)所述蛋白水解可切割接头包含序列LEVLFQGP(SEQIDNO:1)，其中切割在谷氨酰胺和甘氨酸之间进行；b)所述蛋白水解可切割接头包含序列ENLYFQS(SEQIDNO:2)，其中切割在谷氨酰胺和丝氨酸之间进行；c)所述蛋白水解可切割接头包含序列DDDDK(SEQIDNO:3)，其中切割紧邻赖氨酸残基的C-末端进行；或者d)所述蛋白水解可切割接头包含序列I(E/D)GR(SEQIDNO:45)，其中切割紧邻精氨酸残基的C-末端进行；或者e)所述蛋白水解可切割接头包含序列LVPRGS(SEQIDNO:5)。4.根据权利要求1所述的异二聚体多肽，其中所述亲和标记是免疫球蛋白(Ig)Fc多肽、蛋白A、蛋白G、杂合蛋白A-蛋白G多肽、蛋白L多肽、包含聚(组氨酸)段的多肽、免疫球蛋白轻链或谷胱甘肽-S-转移酶。5.根据权利要求1所述的异二聚体多肽，其包含：a)包含HCVE1多肽和亲和标记多肽的HCVE1-亲和标记融合多肽；和b)HCVE2多肽。6.根据权利要求1所述的异二聚体多肽，其包含：a)包含HCVE1多肽和IgFc多肽的HCVE1-Fc融合多肽；和b)HCVE2多肽。7.根据权利要求6所述的异二聚体多肽，其中所述HCVE1-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)所述HCVE1多肽；和ii)所述IgFc多肽。8.根据权利要求6所述的异二聚体多肽，其中所述HCVE1-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)所述IgFc多肽；和ii)所述HCVE1多肽。9.根据权利要求1所述的异二聚体多肽，其包含：a)包含HCVE2多肽和亲和标记多肽的HCVE2-亲和标记融合多肽；和b)HCVE1多肽。10.根据权利要求1所述的异二聚体多肽，其包含：a)包含HCVE2多肽和IgFc多肽的HCVE2-Fc融合多肽；和b)HCVE1多肽。11.根据权利要求10所述的异二聚体多肽，其中所述HCVE2-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)所述HCVE2多肽；和ii)所述IgFc多肽。12.根据权利要求10所述的异二聚体多肽，其中所述HCVE2-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)所述IgFc多肽；和ii)所述HCVE2多肽。13.根据权利要求1所述的异二聚体多肽，其包含：a)包含HCVE1多肽和亲和标记多肽的HCVE1-亲和标记融合多肽；和b)包含HCVE2多肽和亲和标记多肽的HCVE2-亲和标记融合多肽。14.根据权利要求1所述的异二聚体多肽，其包含：a)包含HCVE1多肽和IgFc多肽的HCVE1-Fc融合多肽；和b)包含HCVE2多肽和IgFc多肽的HCVE2-Fc融合多肽。15.根据权利要求14所述的异二聚体多肽，其中：a)所述HCVE1-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)所述HCVE1多肽；和ii)所述IgFc多肽；并且b)所述HCVE2-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)所述HCVE2多肽；和ii)所述IgFc多肽。16.根据权利要求14所述的异二聚体多肽，其中：a)所述HCVE1-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)所述IgFc多肽；和ii)所述HCVE1多肽；并且b)所述HCVE2-Fc融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)所述IgFc多肽；和ii)所述HCVE2多肽。17.根据权利要求1至16中任一项所述的异二聚体多肽，其中所述HCVE2多肽包含与图1A-1C、图2A-2C、图3A-3C和图4A-4B中的一个所示的E2多肽具有至少20％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。18.根据权利要求1至16中任一项所述的异二聚体多肽，其中所述HCVE1多肽包含与图1A-1C、图2A-2C、图3A-3C和图4A-4B所示的E1多肽具有至少20％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。19.根据权利要求1至18中任一项所述的异二聚体多肽，其中所述IgFc多肽包含与图5A-5C所示的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。20.根据权利要求1所述的异二聚体多肽，其包含经亲和标记的HCVE2多肽，其中所述HCVE2-亲和标记融合多肽按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)HCVE2多肽的N-末端的2至15个氨基酸；ii)亲和标记多肽，iii)蛋白水解可切割接头；和iv)HCVE2多肽。21.根据权利要求20所述的异二聚体多肽，其中HCVE2多肽的N-末端的2至15个氨基酸是选自QT、ET、HT、GT、TT、RH、NT、AY、VI和ST的二肽。22.根据权利要求20所述的异二聚体多肽，其中：a)所述蛋白水解可切割接头包含序列LEVLFQGP(SEQIDNO:1)，其中切割在谷氨酰胺和甘氨酸之间进行；b)所述蛋白水解可切割接头包含序列ENLYFQS(SEQIDNO:2)，其中切割在谷氨酰胺和丝氨酸之间进行；c)所述蛋白水解可切割接头包含序列DDDDK(SEQIDNO:3)，其中切割紧邻赖氨酸残基的C-末端进行；d)所述蛋白水解可切割接头包含序列I(E/D)GR(SEQIDNO:45)，其中切割紧邻精氨酸残基的C-末端进行；或者e)所述蛋白水解可切割接头包含序列LVPRGS(SEQIDNO:5)。23.根据权利要求1至22中任一项所述的异二聚体多肽，其中所述HCVE2多肽和所述HCVE1多肽具有相同的基因型。24.根据权利要求1至22中任一项所述的异二聚体多肽，其中所述HCVE2多肽和所述HCVE1多肽具有不同的基因型。25.根据权利要求1至22中任一项所述的异二聚体多肽，其中所述HCVE2多肽具有基因型1、2、3、4、5、6或7。26.根据权利要求1至22中任一项所述的异二聚体多肽，其中所述HCVE1多肽具有基因型1、2、3、4、5、6或7。27.一种组合物，其包含：a)权利要求1至26中任一项所述的异二聚体多肽。28.一种核酸，其包含：a)编码丙型肝炎病毒(HCV)E1多肽的第一核苷酸序列；和b)编码HCVE2多肽的第二核苷酸序列，其中所述HCVE1多肽和所述HCVE2多肽中的至少一个是包含亲和标记多肽的融合多肽。29.根据权利要求28所述的核酸，其中所述核酸包含编码多蛋白的核苷酸序列，所述多蛋白按从N-末端到C-末端的顺序包含：a)HCVE1多肽；和b)HCVE2-亲和标记融合多肽，其按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)亲和标记多肽；ii)蛋白水解可切割接头；和iii)HCVE2多肽。30.根据权利要求29所述的核酸，其中编码HCVE2多肽的N-末端的2个氨基酸至15个氨基酸的核苷酸序列插入在所述HCVE1多肽和所述亲和标记多肽之间，使得在所述HCVE1多肽和所述亲和标记多肽之间产生野生型信号蛋白酶E1/E2连接切割位点。31.根据权利要求28所述的核酸，其中所述核酸包含编码多蛋白的核苷酸序列，所述多蛋白按从N-末端到C-末端的顺序包含：a)HCVE1多肽；和b)HCVE2-亲和标记融合多肽，其按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)HCVE2多肽；ii)蛋白水解可切割接头；和iii)亲和标记多肽。32.根据权利要求28所述的核酸，其中所述核酸包含编码多蛋白的核苷酸序列，所述多蛋白按从N-末端到C-末端的顺序包含：a)HCVE1-亲和标记融合多肽，其按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)亲和标记多肽；ii)蛋白水解可切割接头；和iii)HCVE1多肽；以及b)HCVE2多肽。33.根据权利要求28所述的核酸，其中所述核酸包含编码多蛋白的核苷酸序列，所述多蛋白按从N-末端到C-末端的顺序包含：a)HCVE1-亲和标记融合多肽，其按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)HCVE1多肽；ii)蛋白水解可切割接头；和iii)亲和标记多肽；以及b)HCVE2多肽。34.根据权利要求33所述的核酸，其中编码信号肽的核苷酸序列插入在所述亲和标记多肽和所述HCVE2多肽之间，使得在所述亲和标记多肽和所述HCVE2多肽之间产生信号蛋白酶切割位点。35.根据权利要求28所述的核酸，其中所述核酸包含编码多蛋白的核苷酸序列，所述多蛋白按从N-末端到C-末端的顺序包含：a)HCVE1-亲和标记融合多肽，其按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)亲和标记多肽；ii)蛋白水解可切割接头；和iii)HCVE1多肽；以及b)HCVE2-亲和标记融合多肽，其按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)亲和标记多肽；ii)蛋白水解可切割接头；和iii)HCVE2多肽。36.根据权利要求35所述的核酸，其中编码HCVE2多肽的N-末端的2个氨基酸至15个氨基酸的核苷酸序列插入在所述HCVE1多肽和所述亲和标记多肽之间，使得在所述HCVE1多肽和所述亲和标记多肽之间产生野生型信号蛋白酶E1/E2连接切割位点。37.根据权利要求28所述的核酸，其中所述核酸包含编码多蛋白的核苷酸序列，所述多蛋白按从N-末端到C-末端的顺序包含：a)HCVE1-亲和标记融合多肽，其按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)HCVE1多肽；ii)蛋白水解可切割接头；和iii)亲和标记多肽；以及b)HCVE2-亲和标记融合多肽，其按从N-末端到C-末端的顺序包含：i)HCVE2多肽；ii)蛋白水解可切割接头；和iii)亲和标记多肽。38.根据权利要求37所述的核酸，其中编码信号肽的核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·霍顿，D·霍克曼，J·L·劳，陈超，M·洛根，
申请(专利权)人：艾伯塔大学理事会，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA