四价多特异性抗体制造技术

本发明专利技术涉及新的四价多特异性抗体、其制备和用途。

Tetravalent and multi specific antibody

The invention relates to a new quadruvalent multi specific antibody, its preparation and application.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】四价多特异性抗体
本专利技术涉及新的四价多特异性抗体、其制造和用途。
技术介绍
工程化的蛋白质，如能够结合两种或更多种抗原的双特异性或多特异性抗体是本领域已知的。可以使用细胞融合、化学缀合或重组DNA技术产生此类多特异性结合蛋白。近来已经开发了多种重组多特异性抗体形式，例如，通过融合例如IgG抗体形式与单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Coloma,M.J.等人NatureBiotech.15(1997)159-163；WO2001/077342；和Morrison,S.L.,NatureBiotech.25(2007)1233-1234)。产生多特异性抗体的一个缺点是除了所需的功能分子之外，形成各种不需要的副产物。错配包括将错误的重链相互配对、以及将轻链与错误的重链对应物配对或不需要的轻链配对。当产生双特异性抗体时，一种避免错配副产物问题的方法称为“杵臼(knob-into-hole)技术”，其旨在通过将突变引入CH3结构域以修饰接触界面来强制配对两种不同的抗体重链。在一条链上，大体积氨基酸被具有短侧链的氨基酸置换以产生“臼”。相反，具有大侧链的氨基酸被引入到另一个CH3结构域中，以产生“杵”。通过共表达这两条重链(和两条相同的轻链，其必须适用于两条重链)，相对于同二聚体形成(“臼-臼”或“杵-杵”)观察到高产率的异二聚体形成(“杵-臼”)(Ridgway,J.B.等人,ProteinEng.9(1996)617-621；和WO96/027011)。通过使用噬菌体展示方法重塑两个CH3结构域的相互作用表面并引入二硫键桥以稳定异二聚体可进一步增加异二聚体的百分比(Merchant,A.M.等人,NatureBiotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26–35)。杵臼技术的新方法在例如EP1870459A1中描述。虽然这种形式看起来非常有吸引力，但目前还没有数据描述向临床的进展。该策略的一个重要限制是为了防止错配副产物的形成，两个亲本抗体的轻链必须相同以防止错配和形成无活性分子。因此，该技术不适合作为从针对第一和第二抗原的两种抗体出发容易地开发针对三种或四种抗原的重组三或四特异性抗体的基础，因为这些抗体的重链和/或相同轻链必须首先被优化，然后必须加入针对第三和第四抗原的另外的抗原结合肽。涉及异二聚化多肽的WO2013/02362中描述了用于支持Fc结构域配对的其他方法。WO2013/12733涉及包含异二聚化Fc区的多肽。WO2012/131555涉及工程化的异二聚体免疫球蛋白。EP2647707涉及工程化的异二聚体免疫球蛋白。避免在双特异性抗体产生中错配副产物问题的一种方法旨在强制轻链多肽与其正确的重链对应物配对。这种被称为“CrossMab技术”的方法基于重链和轻链之间的结构域交叉，从而为不同特异性的重链和轻链创建不同的结构域排列。WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254和Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191涉及具有结构域交叉的二价双特异性IgG抗体。WO2010/145792和WO2010/145792涉及具有结构域交叉的四价抗原结合蛋白。在WO2009/080252中描述的在一个结合位点中具有VH/VL置换/交换以预防轻链错配的多特异性抗体(CrossMabVH-VL)(还参见Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191)明显减少由针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链的错配引起的副产物(与没有这样的结构域交换的方法相比)。然而，其制剂并没有完全无副产物。主要副产物基于错误的轻链与结构域交换的重链的Bence-Jones型相互作用(也参见Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191；在增补中的图S1I)。WO2015/101588A1涉及血脑屏障穿梭组件。WO2015/101588A1提及在一个结合臂中具有VH/VL结构域交叉的在CH1/CL界面中具有突变的二价双特异性抗体。WO2015/101588A1没有提及所述突变的技术效果。仍需要进一步减少此类副产物以改善例如此类双特异性抗体的纯度。特征在于使其适用于治疗用途的抗体也可以得到改善。
技术实现思路
一方面，本专利技术涉及四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合第一抗原的两个Fab片段，和b)两个另外的Fab片段，其中所述另外的Fab片段都在核心抗体重链的C-末端或N-末端融合，其中另外的Fab片段特异性结合第二抗原，i)其中-特异性结合第一抗原的Fab片段，或-特异性结合第二抗原的Fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)彼此置换，和ii)其中-特异性结合第一抗原的Fab片段，或-特异性结合第二抗原的Fab片段在恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域1(CH1)中包含以下氨基酸取代：-在CL结构域中位置124的氨基酸被K、R或H取代(根据Kabat编号)，和-在CH1结构域中位置147或213的氨基酸被E或D取代(根据KabatEU索引编号)。在根据本专利技术第一方面的抗体的一个实施方案中，不包含i)中结构域交叉的Fab片段包含ii)中的氨基酸取代。另一方面，本专利技术涉及四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含分别特异性结合第一抗原和第二抗原的两个Fab片段，和b)两个另外的Fab片段，其中所述另外的Fab片段都在核心抗体重链的C-末端或N-末端融合，其中与重链融合的另外的Fab片段表现出与排列在所述重链上的核心抗体的Fab片段相同的抗原结合特异性，i)其中-特异性结合第一抗原的Fab片段，或-特异性结合第二抗原的Fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)彼此置换，和ii)其中-特异性结合第一抗原的Fab片段，或-特异性结合第二抗原的Fab片段在恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域1(CH1)中包含以下氨基酸取代：-在CL结构域中位置124的氨基酸被K、R或H取代(根据Kabat编号)，和-在CH1结构域中位置147或213的氨基酸被E或D取代(根据KabatEU索引编号)。在根据本专利技术第二方面的抗体的一个实施方案中，不包含i)中结构域交叉的Fab片段包含ii)中的氨基酸取代。本专利技术的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的Fab片段中，在CH1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被E或D取代(根据KabatEU索引编号)。本专利技术的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的Fab片段中，在CL结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被K、R或H取代(根据Kabat编号)。本专利技术的一个实施方案涉及多特异性抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的Fab片段中，在CH1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被E或D取代，并且在CL结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被K、R或H取代(根据Kab本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合第一抗原的两个Fab片段，和b)两个另外的Fab片段，其中所述另外的Fab片段都在核心抗体重链的C‑末端或N‑末端融合，其中所述另外的Fab片段特异性结合第二抗原，i)其中‑特异性结合第一抗原的Fab片段，或‑特异性结合第二抗原的Fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)彼此置换，和ii)其中‑特异性结合第一抗原的Fab片段，或‑特异性结合第二抗原的Fab片段在恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域1(CH1)中包含以下氨基酸取代：‑CL结构域中位置124的氨基酸被K、R或H取代(根据Kabat编号)，和‑CH1结构域中位置147或213的氨基酸被E或D取代(根据KabatEU索引编号)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.02 EP 15188057.21.一种四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含特异性结合第一抗原的两个Fab片段，和b)两个另外的Fab片段，其中所述另外的Fab片段都在核心抗体重链的C-末端或N-末端融合，其中所述另外的Fab片段特异性结合第二抗原，i)其中-特异性结合第一抗原的Fab片段，或-特异性结合第二抗原的Fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)彼此置换，和ii)其中-特异性结合第一抗原的Fab片段，或-特异性结合第二抗原的Fab片段在恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域1(CH1)中包含以下氨基酸取代：-CL结构域中位置124的氨基酸被K、R或H取代(根据Kabat编号)，和-CH1结构域中位置147或213的氨基酸被E或D取代(根据KabatEU索引编号)。2.一种四价多特异性抗体，其包含a)由全长抗体形成的一个核心抗体，所述全长抗体包含分别特异性结合第一抗原和第二抗原的两个Fab片段，和b)两个另外的Fab片段，其中所述另外的Fab片段都在核心抗体重链的C-末端或N-末端融合，其中与重链融合的另外的Fab片段表现出与在所述重链上排列的核心抗体的Fab片段相同的抗原结合特异性，i)其中-特异性结合第一抗原的Fab片段，或-特异性结合第二抗原的Fab片段包含结构域交叉，使得可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)彼此置换，和ii)其中-特异性结合第一抗原的Fab片段，或-特异性结合第二抗原的Fab片段在恒定轻链结构域(CL)和恒定重链结构域1(CH1)中包含以下氨基酸取代：-CL结构域中位置124的氨基酸被K、R或H取代(根据Kabat编号)，和-CH1结构域中位置147或213的氨基酸被E或D取代(根据KabatEU索引编号)。3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中不包含i)中的结构域交叉的一个或两个Fab片段包含ii)中的氨基酸取代。4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的Fab片段中-CL结构域中位置123和124的氨基酸彼此独立地被K和R取代(根据Kabat编号)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中在包含ii)中的氨基酸取代的Fab片段中，-CL结构域中位置123的氨基酸被R取代和位置124的氨基酸被K取代(根据Kabat编号)，和-CH1结构域中位置147和213的氨基酸彼此独立地被E或D取代(根据KabatEU索引编号)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中不包含ii)中定义的氨基酸取代的Fab片段在CL结构域中包含以下氨基酸取代-位置124的...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·布鲁恩克尔，S·伊姆霍夫容，C·克莱因，M·柯尼格，M·莫尔霍伊，J·T·雷古拉，S·西伯尔，W·舍费尔，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH