快解离速率的血清白蛋白结合性纤连蛋白III型结构域制造技术

本文中提供了包含与血清白蛋白结合的纤连蛋白III型第十结构域(10Fn3)的多肽。还提供了在诊断和治疗应用中使用的包含与异源蛋白连接的血清白蛋白结合性10Fn3的融合分子。

Fast dissociation rate of serum albumin binding fibronectin type III domain

A polypeptide containing fibronectin III type tenth domain (10Fn3), which is bound to serum albumin, is provided in this paper. Fusion molecules containing serum albumin binding 10Fn3, which are linked to heterologous proteins, are also provided in diagnostic and therapeutic applications.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】快解离速率的血清白蛋白结合性纤连蛋白III型结构域本申请要求2015年9月23日提交的美国临时申请No.62/222,508的优先权，将其内容通过提述明确并入本文。在整个本说明书中引证的任何专利、专利申请、和参考文献的内容都通过提述完整并入本文。背景治疗剂的半衰期不足常常迫使以其高频率和/或较高剂量进行给药、或使用持续释放制剂，以便维持疗效所必需的血清水平。然而，这常常与消极副作用相关。克服半衰期不足的一个策略是将治疗剂与延长半衰期的多肽融合。然而，虽然延长半衰期可能是有益的，但过度稳定的治疗剂也可能导致消极副作用。因此，微调治疗剂半衰期的能力可能是有益的。本申请提供了微调各种治疗剂的血清半衰期的化合物和产生所述化合物的方法。概述本专利技术至少部分基于新型的结合人血清白蛋白(HSA)的纤连蛋白III型第十(10Fn3)结构域的开发，这样的结构域在控制融合伴侣(例如，治疗性多肽)的半衰期方面有多种多样的应用。在一个方面，本文中提供了包含10Fn3结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域以1μM或更小的KD与HSA结合并且包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环，其中，相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的CD和FG环，所述CD环具有1、2或3个氨基酸取代，所述FG环任选地具有1、2或3个氨基酸取代，并且其中与10Fn3结构域连接的模块(例如，多肽)的血清半衰期相对于未与10Fn3结构域连接的模块的血清半衰期延长。在某些实施方案中，所述多肽以比包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的kd更大的解离速率(kd)与HSA结合。在某些实施方案中，所述多肽的解离速率与包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的解离速率的比率为至少约3。在某些实施方案中，所述比率为至少约25。在某些实施方案中，所述比率为至少约25。在某些实施方案中，所述比率为至少约50。在某些实施方案中，所述多肽与HSA结合的结合速率(ka)在包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的ka的一个数量级之内(即，10倍之内)。在某些实施方案中，所述CD环相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的相应CD环具有1个或2个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述FG环相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的FG环具有1个氨基酸取代。在某些实施方案中，相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的CD环和FG环，所述CD环具有1个氨基酸取代并且所述FG环具有1个取代。在某些实施方案中，所述10Fn3结构域的CD环相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的相应CD环具有1个或2个氨基酸取代，其中所述1个或2个取代选自下组：(i)在CD环(SEQIDNO:28)第2位的精氨酸(R)被选自D、E、A、Q或N的氨基酸取代；(ii)在CD环(SEQIDNO:28)第5位的谷氨酰胺(Q)被D取代；(iii)在CD环(SEQIDNO:28)第7位的酪氨酸(Y)被选自S或A的氨基酸取代；(iv)在CD环(SEQIDNO:28)第10位的亮氨酸(L)被选自S、T或A的氨基酸取代；(v)在CD环(SEQIDNO:28)第13位的亮氨酸(L)被选自D、S或A的氨基酸取代；(vi)在CD环(SEQIDNO:28)第14位的酪氨酸(Y)被选自A或T的氨基酸取代；(vii)在CD环(SEQIDNO:28)第15位的异亮氨酸(I)被选自D、S或A的氨基酸取代；以及(viii)在CD环(SEQIDNO:28)第16位的酪氨酸(Y)被选自Q、E、S或A的氨基酸取代。在某些实施方案中，所述10Fn3结构域相对于如上所述的包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的相应CD环具有1个或2个氨基酸取代，和/或所述10Fn3结构域相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的相应FG环具有1个氨基酸取代。在某些实施方案中，在FG环(SEQIDNO:29)第12位的赖氨酸(K)被选自A、T或S的氨基酸取代。在某些实施方案中，所述多肽包含与SEQIDNO:23-27、30-34、36-40、42-46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、62、63、65-68、70、71、73-76、78、79、81-84、86、87、89-98、100-109和111-118中任一者的非CD环区至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，任选地，条件是所述序列不是ADX_2629_E06的序列。在某些实施方案中，所述多肽包含与SEQIDNO:30-34、36-40、42-46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、62、63、65-68、70、71、73-76、78、79、81-84、86、87、89-98、100-109和111-118至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，任选地，条件是所述序列不是ADX_2629_E06的序列。在某些实施方案中，10Fn3结构域与HSA的结构域I-II结合。在某些实施方案中，本文所述的多肽进一步包括异源蛋白，比如治疗模块(例如，10Fn3域)。在某些方面，本文中提供了包含多肽或融合多肽和载体(例如，药学上可接受的载体)的组合物(例如，药物组合物)，所述多肽包含HSA结合性10Fn3结构域的任一种，所述融合多肽包含如本文所述的HSA结合性10Fn3结构域。在某些方面，本文中提供了编码HSA结合性10Fn3结构域或包含如本文所述的HSA结合性10Fn3结构域的融合多肽中的任一种的分离的核酸(例如，编码SEQIDNO:30-34、36-40、42-46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、62、63、65-68、70、71、73-76、78、79、81-84、86、87、89-98、100-109和111-118中任一者的分离的核酸)、包含所述核酸的表达载体以及包含所述核酸分子的细胞。在某些方面，本文中提供了产生HSA结合性10Fn3结构域或包含如本文所述的HSA结合性10Fn3结构域的融合多肽的方法，所述方法包括在适于表达10Fn3结构域或融合多肽的条件下培养包含编码它们的核酸分子的细胞，并纯化所述结构域或融合多肽。在某些方面，本文中提供了增强模块的半衰期的方法，其包括将所述模块与本文所述的HSA结合性10Fn3结构域连接。附图简述图1和2是与HSA结合的Adnectin的SPR传感图，将其在解离阶段开始时归一化以说明结合的解离速率的差异。图3显示了与HSA和小鼠血清白蛋白(MSA)结合的另外的Adnectin的SPR传感图，将其在解离阶段开始时归一化以说明结合的解离速率的差异。图4A-4D是用于确定对HSA、MSA、大鼠血清白蛋白(大鼠SA)和食蟹猴血清白蛋白(食蟹猴SA)亲和力的亲本Adnectin(ADX_7016_A01；PKE2)以及7016_C03、7016_E0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含纤连蛋白III型第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域以1μM或更小的KD与人血清白蛋白(HSA)结合，并且包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环，其中，相对于包含SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的CD和FG环，所述CD环具有1、2或3个氨基酸取代，并且所述FG环任选地具有1、2或3个氨基酸取代，并且其中相对于未与10Fn3结构域连接的模块的血清半衰期，与10Fn3结构域连接的模块(例如，多肽)的血清半衰期延长。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.23 US 62/222,5081.一种包含纤连蛋白III型第十(10Fn3)结构域的多肽，其中所述10Fn3结构域以1μM或更小的KD与人血清白蛋白(HSA)结合，并且包含AB、BC、CD、DE、EF和FG环，其中，相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的CD和FG环，所述CD环具有1、2或3个氨基酸取代，并且所述FG环任选地具有1、2或3个氨基酸取代，并且其中相对于未与10Fn3结构域连接的模块的血清半衰期，与10Fn3结构域连接的模块(例如，多肽)的血清半衰期延长。2.权利要求1的多肽，所述多肽结合HSA的解离速率(kd)大于比包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的kd。3.权利要求1或2的多肽，所述多肽结合HSA的结合速率(ka)在包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的ka的一个数量级之内(即，10倍之内)。4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述CD环相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的相应CD环具有2个氨基酸取代。5.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述CD环相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的CD环具有1个氨基酸取代。6.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述FG环相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的FG环具有1个氨基酸取代。7.权利要求1-3中任一项的多肽，其中相对于包含SEQIDNO:23中列出的氨基酸序列的10Fn3结构域的CD环和FG环，所述CD环具有1个氨基酸取代，并且所述FG环具有1个取代。8.权利要求4的多肽，其中所述2个氨基酸取代选自下组：(i)在CD环(SEQIDNO:28)第2位的精氨酸(R)被选自D、E、A、Q或N的氨基酸取代；(ii)在CD环(SEQIDNO:28)第5位的谷氨酰胺(Q)被D取代；(iii)在CD环(SEQIDNO:28)第7位的酪氨酸(Y)被选自S或A的氨基酸取代；(iv)在CD环(SEQIDNO:28)第10位的亮氨酸(L)被选自S、T或A的氨基酸取代；(v)在CD环(SEQIDNO:28)第13位的亮氨酸(L)被选自D、S或A的氨基酸取代；(vi)在CD环(SEQIDNO:28)第14位的酪氨酸(Y)被选自A或T的氨基酸取代；(vii)在CD环(SEQIDNO:28)第15位的异亮氨酸(I)被选自D、S或A的氨基酸取代；以及(viii)在CD环(SEQIDNO:28)第16位的酪氨酸(Y)被选自Q、E、S或A的氨基酸取代。9.权利要求5的多肽，其中所述1个氨基酸取代选自下组：(i)在CD环(SEQIDNO:28)第2位的精氨酸(R)被选自D、E、A、Q或N的氨基酸取代；(ii)在CD环(SEQIDNO:28)第5位的谷氨酰胺(Q)被D取代；(iii)在CD环(SEQIDNO:28)第7位的酪氨酸(Y)被选自S或A的氨基酸取代；(iv)在CD环(SEQIDNO:28)第10位的亮氨酸(L)被选自S、T或A的氨基酸取代；(v)在CD环(SEQIDNO:28)第13位的亮氨酸(L)被选自D、S或A的氨基酸取代；(vi)在CD环(SEQIDNO:28)第14位的酪氨酸(Y)被选自A或T的氨基酸取代；(vii)在CD环(SEQIDNO:28)第15位的异亮氨酸(I)被选自D、S或A的氨基酸取代；以及(viii)在CD环(SEQIDNO:28)第16位的酪氨酸(Y)被选自Q、E、S或A的氨基酸取代。10.权利要求9的多肽，其中在CD环(SEQIDNO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：小斯坦利·R·克瑞什特克，T·S·米切尔，M·L·戈瑟兰，D·利波夫塞克，J·朱内贾，
申请(专利权)人：百时美施贵宝公司，
类型：发明
国别省市：美国,US