长效FGF21融合蛋白及包含其的药物组合物制造技术

本发明专利技术提供了包含FGF21突变蛋白和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白。根据本发明专利技术的融合蛋白表现出提高的药理学效力、体内持续时间和蛋白质稳定性，并且包含所述融合蛋白作为活性成分的药物组合物可以有效地用作治疗剂以用于糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎。

Long acting FGF21 fusion protein and pharmaceutical composition containing the same

The present invention provides a fusion protein containing Fc region of FGF21 mutant protein and immunoglobulin. The fusion protein in accordance with the invention shows an improved pharmacological effect, in vivo duration and protein stability, and a pharmaceutical composition containing the fusion protein as an active component can be effectively used as a therapeutic agent for diabetes, obesity, dyslipidemia, metabolic syndrome, non-alcoholic fatty liver disease, or non - alcoholic fatty liver disease. Alcoholic steatohepatitis (alcoholic steatohepatitis).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】长效FGF21融合蛋白及包含其的药物组合物
本专利技术涉及具有提高的体内持续时间、蛋白质稳定性和药理学活性的包含成纤维细胞生长因子21(fibroblastgrowthfactor21，FGF21)突变蛋白的融合蛋白，和包含所述融合蛋白的药物组合物。
技术介绍
在肝中合成的成纤维细胞生长因子21(FGF21)是已知在葡萄糖和脂质稳态中起重要作用的激素。FGF21在表达FGF21特异性受体(即FGF受体)和β-klotho复合物二者的肝、脂肪细胞、胰腺β细胞、脑中的下丘脑和肌肉组织中展示药理学作用。已经报道，在多种糖尿病和代谢疾病的非人灵长类动物和鼠模型中，FGF21可以以胰岛素非依赖性方式降低血糖水平、减轻体重和降低血液中的甘油三酯和低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，LDL)浓度。此外，由于其提高胰岛素敏感性的作用，FGF21具有开发作为糖尿病和肥胖的新治疗剂的潜力(参见WO2003/011213)。因此，为了开发基于FGF21的新抗糖尿病药，已经尝试了通过基于野生型FGF21序列通过替换、插入和缺失一些氨基酸构建FGF21突变体来提高其生物学活性和体内稳定性(参见WO2010/065439)。然而，由于FGF21具有非常短的半衰期，已经证明如果直接用作生物治疗剂，其是有问题的(Kharitonenkov，A.等(2005)JournalofClinicalInvestigation115：1627-1635)。在小鼠中，FGF21的体内半衰期为1至2小时，并且在猴中为2.5至3小时。因此，对于FGF21以其当前形式用作用于糖尿病的治疗剂，需要每日施用。已经报道了尝试提高FGF21重组蛋白的体内半衰期的多种方法。一个这样的实例是将聚乙二醇(PEG)(即聚合物材料)与FGF21连接以增加其分子量，由此抑制肾排泄并提高体内保留时间(参见WO2012/066075)。另一种方法尝试通过将其与结合至人白蛋白的脂肪酸融合来提高半衰期(参见WO2012/010553)。另一个实例尝试通过产生激动剂抗体来在维持与在野生型FGF21等同的药理学活性的同时提高半衰期，所述激动剂抗体与单独或作为与β-klotho复合物的人FGF受体特异性结合(参见WO2012/170438)。在另一个实例中，通过制备长效融合蛋白来提高半衰期，在所述长效融合蛋白中IgG的Fc区与FGF21分子融合(参见WO2013/188181)。在多种可用于产生长效药物的技术中，Fc融合技术被广泛使用，因为其具有更少在其他方法中所见的缺点，例如在提高体内半衰期的同时诱导免疫应答或毒性。为了开发Fc融合的FGF21蛋白作为长效治疗药物，应满足以下条件。首先，应最小化由融合引起的体外活性降低。FGF21的N端和C端二者都参与FGF21的活性。就此而言，已知FGF21融合蛋白的活性根据融合位置而大不相同。因此，取决于融合的存在/不存在或位置，其中突变被引入到FGF21中的Fc融合的FGF21融合蛋白的活性可以改变。其次，可以通过融合提高体内半衰期来实现能够在人中以每周一次间隔施用的药代动力学谱。第三，考虑到预期在施用生物药物后在大多数患者中可能出现免疫原性，因此应最小化由融合接头或突变引起的免疫原性风险。第四，融合位置或引入突变不应引起稳定性问题。第五，由于取决于融合的免疫球蛋白的同种型可能发生不希望的免疫应答，因此需要防止这样的应答的解决方案。已经报道了通过将免疫球蛋白G(IgG)的Fc区与FGF21分子连接来开发长效融合蛋白的尝试(参见WO2013/188181)。在其中Fc与野生型FGF21的N端融合的一种Fc-FGF21结构的情况下，尽管与野生型FGF21相比在体外活性方面没有明显差异，但是已知由于蛋白质的体内降解，半衰期非常短。为了解决这一问题，已经尝试通过在FGF21的特定位点位置处引入数种突变以抵抗蛋白质降解来提高体内半衰期。然而，在引入多重突变的情况下，免疫原性风险可能提高。相比之下，在其中Fc与FGF21分子的C端融合的FGF21-Fc结构的情况下，已知当与Fc-FGF21结构相比时，在该位点的融合引起活性显著降低。本专利技术人努力提高FGF21的生理活性和稳定性，并且发现当向FGF21的特定位置引入突变并使免疫球蛋白Fc区与其连接时，可以提高FGF21的药理学效力并且可以增加FGF21的体内暴露和半衰期而不损害体外活性，从而完成本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个目的是提供具有提高的体内持续时间、蛋白质稳定性和药理学效力的包含FGF21突变蛋白的融合蛋白。本专利技术的另一个目的是提供包含所述融合蛋白的药物组合物。本专利技术的另一个目的是提供编码所述融合蛋白的分离的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。问题的解决方案本专利技术提供了包含FGF21突变蛋白和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQIDNO：42)；(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQIDNO：43)；(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQIDNO：44)；(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，以及上述突变(1)至(5)的一种或更多种；和(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。此外，本专利技术提供了包含所述融合蛋白的药物组合物，其用于治疗糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎。此外，本专利技术提供了编码所述融合蛋白的分离的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。有益效果通过将人免疫球蛋白的Fc区与FGF21突变蛋白连接而制备的本专利技术融合蛋白具有提高的体内持续时间、蛋白质稳定性和药理学效力。此外，包含所述融合蛋白作为活性成分的药物组合物可以用作糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎的治疗剂。特别地，与包含FGF21蛋白的常规药物组合物相比，本专利技术的药物组合物由于FGF21融合蛋白的提高的体内稳定性而具有长施用间隔的优点。附图简述图1A至1C是显示通过使用其中过表达人β-klotho的HEK293细胞系的包含FGF21突变蛋白的融合蛋白(以下称为“FGF21突变体融合蛋白”)体外活性的测量结果的图。由于引入突变，FGF21突变体融合蛋白变体未显示活性显著降低。图2A和2B是显示通过使用其中过表达人β-klotho的HEK293细胞系根据将FGF21的N端与Fc区连接的接头的FGF21突变体融合蛋白体外活性的测量结果的图。FGF21突变体融合蛋白变体未显示活性显著降低，但是根据接头序列在活性方面观察到微小差异。图3是显示使用其中过表达人β-klotho的HEK293细胞系的RGE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQ ID NO：42)；(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQ ID NO：43)；(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQ ID NO：44)；(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，以及上述突变(1)至(5)的一种或更多种；和(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.28 KR 10-2015-01505741.包含成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQIDNO：42)；(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQIDNO：43)；(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQIDNO：44)；(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，以及上述突变(1)至(5)的一种或更多种；和(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中通过突变引入的所述FGF21突变蛋白的氨基酸残基N是糖基化的。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述野生型FGF21蛋白具有由SEQIDNO：1表示的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述FGF21突变蛋白具有由SEQIDNO：6至23中任一个表示的...

【专利技术属性】
技术研发人员：金埈焕，林世荣，徐旼志，崔铉浩，金度勋，朱美敬，朴珠英，崔秉贤，李埈卿，金锺均，南受延，
申请(专利权)人：株式会社柳韩洋行，
类型：发明
国别省市：韩国,KR