用于制造合成的拖丝蜘蛛丝的组合物和方法技术

提供了包含源自Ma SP的蛋白质的混合物的组合物、编码其的核酸和制备合成拖丝蜘蛛丝的方法。本发明专利技术的组合物包含不同分子量的蛋白质的混合物，其中所述混合物的每种蛋白质独立地包含多个重复的Ma SP(大壶状腺丝蛋白)蛋白的重复区或其功能同系物、变体、衍生物或片段。

Composition and method for manufacturing synthetic spider silk

A composition comprising a mixture of proteins derived from Ma SP, a nucleic acid encoding it and a method for preparing spider silk are also provided. The composition of the present invention comprises a mixture of proteins of different molecular weights, in which each protein of the mixture independently comprises a repeated area of multiple repeated Ma SP (large pot like adenosin) protein or its functional homologue, variant, derivative, or fragment.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制造合成的拖丝蜘蛛丝的组合物和方法本申请要求于2015年8月10日提交的美国临时专利申请号62/203,102，于2016年2月11日提交的美国临时专利申请号62/293,880以及于2016年4月3日提交的美国临时专利申请号62/317,572的优先权。上述文件的内容通过引用以其全部并入，如同在此完全阐述一样。
本专利技术涉及用于制备合成的拖丝蜘蛛丝(draglinespidersilk)的包含源自MaSP(大壶状腺丝蛋白(majorampullatespidroin))蛋白的蛋白质混合物的组合物。专利技术背景拖丝蜘蛛丝在本领域中被称为由织网蜘蛛(orb-webweavingspider)在它们跌落或逃离危险时构建它们的网的框架和幅射线以及生命线所使用的丝。为了能够完成这些任务，由于高弹性和强度的组合，拖丝纤维(draglinefiber)显示出非常高的韧性，这使其成为最坚韧的纤维，无论是天然的还是人造的。例如，拖丝的直径比高强度钢强6倍，比凯夫拉(Kevlar)——其是曾经制备的最强的合成纤维之一——坚韧3倍。拖丝由两种主要多肽组成，通常被称为大壶状腺丝蛋白(MaSp)1和2，在十字园蛛(Araneusdiadematus)中也被称为ADF-3和ADF-4。这些蛋白质的表观分子量在200-720kDa范围内，这取决于样品的年龄和分析条件。已知的拖丝蛛丝蛋白由交替的富含丙氨酸的片段——在纤维中形成结晶的β-片层——和富含甘氨酸的片段——其更具柔性并且主要缺乏有序结构——的高度重复的区段组成。C-端区域不重复，在物种之间高度保守，并且采用α-螺旋构象。拖丝蛋白的N-端区域也被发现在不同的蛛丝蛋白之间以及不同的蜘蛛物种之间高度保守。已经进行了许多尝试来合成地产生蜘蛛丝，如通过在组织培养中使用细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞以及甚至转基因山羊进行基因工程。美国专利号8,461,301尤其涉及包含半合成蜘蛛丝蛋白结构域或其任何功能同系物、变体、衍生物、片段或突变体的多个重复的分离的氨基酸序列。该出版物通过引用以其全部并入本文。有关拖丝蜘蛛丝的其他出版物包括但不限于Ittah,S.,etal.Biopolymers,93(5),458-468,2010；Ittah,S.,etal.Biomacromolecules,8(9),2768-2773,2007；Ittah,S.,etal.,Biomacromolecules,7(6),1790-1795,2006；和Huemmerich,D.,Ittah,S.,etal.,CurrentBiology,14,2070-2074,2004。这些出版物通过引用以其全部并入本文。对用于生产具有类似于天然蜘蛛丝机械性能的纤维的改进组合物和方法存在未满足的需求。
技术实现思路
本专利技术涉及包含具有不同分子量并源自MaSP蛋白的蛋白质混合物的组合物，诸如用于制造合成的拖丝蜘蛛丝。根据一些方面，提供了一种组合物，其包含含有m种类型的不同分子量的蛋白质的蛋白质混合物，其中所述混合物中的每种蛋白质独立地包含n个重复的源自MaSP蛋白的重复区、或其功能同系物、变体、衍生物或片段，其中m和n独立地为2-70之间的整数。在一些实施方式中，所述MaSP蛋白是选自MaSP-1、MaSP-2、ADF-4和ADF-3的蛋白质。在一些实施方式中，所述MaSP蛋白是选自MaSP-1和ADF-4的蛋白质。在一些实施方式中，所述n对于所述混合物中的每种类型的蛋白质是相同的。在另一个实施方式中，n是等于4和32或在4和32之间的整数。在另一个实施方式中，m是等于4和32或在4和32之间的整数。在另一个实施方式中，'n'与'm'的比在2：1至1：2的范围内。在另一个实施方式中，'n'和'm'是相等的。在另一个实施方式中，每个重复具有2kDa至3.5kDa范围内的分子量。在另一个实施方式中，每个重复序列具有2.6kDa至3kDa范围内的分子量。在另一个实施方式中，组合物包含分子量增量为2kDa至3.5kDa的所述混合物的两种或更多种蛋白质。在另一个实施方式中，组合物包含分子量增量为2.6kDa至3kDa的所述混合物的两种或更多种蛋白质。在一些实施方式中，所述重复具有MaSP蛋白或其片段的重复区的同系物、变体、衍生物。在一些实施方式中，所述重复具有MaSP1蛋白或其片段的重复区的同系物、变体、衍生物。在一些实施方式中，所述重复具有ADF-4蛋白或其片段的重复区的同系物、变体、衍生物。在一些实施方式中，所述重复区具有第一部分和与其邻接的第二部分，第一部分是包含至少50％丙氨酸残基的5-30个氨基酸的氨基酸序列，第二部分是包含至少80％选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸的残基的20-60个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述重复区的第二部分包含至多两个谷氨酰胺残基。在一些实施方式中，所述重复区具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列：(X1)ZX2GPGGYGPX3X4X5GPX6GX7GGX8GPGGPGX9X10其中X1独立地在每种情况下为A或G，其中至少50％的(X1)z为A，Z为5至30之间的整数；X2为S或G；X3为G或E；X4为G、S或N；X5为Q或Y；X6为G或S；X7为P或R；X8为Y或Q；X9为G或S；并且X10为S或G。在一些实施方式中，所述重复区包含如SEQIDNO：33所示的氨基酸序列：(X1)ZX2SGPX3GGYGX4PX5QGPX6GGYGP其中X1独立地在每种情况下为A或G，其中至少50％的(X1)z为A，Z为5至30之间的整数；X2为S-G或不存在；X3为G-Q或不存在；X4为G或不存在；X5为S或G；X6为S-P、G-R或不存在。在另一个实施方式中，所述重复区包含如SEQIDNO：34(PGGYGP)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区具有如SEQIDNO：2-4中任一个所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述同系物与SEQIDNO：1-3中的任一个共享至少70％的同源性。在另一个实施方式中，所述重复区具有如SEQIDNO：2-4和35-44中任一个所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述同系物与SEQIDNO：1-3、33和35-44中的任一个共享至少70％的同源性。在另一个实施方式中，所述重复区包含如SEQIDNO：2(SGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSS)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如SEQIDNO：3(AAAAAAAASGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSS)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如SEQIDNO：35(SGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSSAGAGAGAAA)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含如SEQIDNO：36(SGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSSAGAGAGAGA)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述重复区包含SEQIDNO：35(SGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSSAGAGAGAAA)和SEQIDNO：36(SGPGGYGPGSQGPSGPGGYGPGGPGSSAGAGAGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组合物，其包含蛋白质混合物，所述蛋白质混合物包含m种类型的不同分子量的蛋白质，其中所述混合物中的每种蛋白质独立地包含n个重复的大壶状腺丝蛋白(MaSP)的重复区、或其功能同系物、变体、衍生物或片段，其中m和n独立地为2‑70之间的整数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.10 US 62/203,102;2016.02.11 US 62/293,880;1.组合物，其包含蛋白质混合物，所述蛋白质混合物包含m种类型的不同分子量的蛋白质，其中所述混合物中的每种蛋白质独立地包含n个重复的大壶状腺丝蛋白(MaSP)的重复区、或其功能同系物、变体、衍生物或片段，其中m和n独立地为2-70之间的整数。2.权利要求1所述的组合物，其中所述n对于所述混合物中的每种类型的蛋白质是相同的。3.权利要求1所述的组合物，其中每个重复具有2kDa至3.5kDa范围内的分子量。4.权利要求3所述的组合物，其中每个重复具有2.6kDa至3kDa范围内的分子量。5.权利要求1所述的组合物，其包含分子量增量为2kDa至3.5kDa的所述混合物的两种或更多种蛋白质。6.权利要求1所述的组合物，其包含分子量增量为2.6kDa至3kDa的所述混合物的两种或更多种蛋白质。7.权利要求1所述的组合物，其中n是等于4和32或在4和32之间的整数。8.权利要求1所述的组合物，其中m是等于4和32或在4和32之间的整数。9.权利要求1所述的组合物，其中'n'与'm'的比在2:1–1:2的范围内。10.权利要求1所述的组合物，其中'n'和'm'相等。11.权利要求1所述的组合物，其中所述重复具有ADF-4或MaSP1蛋白或其片段的重复区的同系物、变体、衍生物。12.权利要求1所述的组合物，其中所述重复区具有第一部分和与其邻接的第二部分，所述第一部分是包含至少50％丙氨酸残基的5-30个氨基酸的氨基酸序列，所述第二部分是包含至少80％选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸的残基的20-60个氨基酸的氨基酸序列。13.权利要求12所述的组合物，其中所述重复区的所述第二部分包含至多两个谷氨酰胺残基。14.权利要求1所述的组合物，其中所述重复区具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列：(X1)ZX2GPGGYGPX3X4X5GPX6GX7GGX8GPGGPGX9X10其中X1独立地在每种情况下为A或G，其中至少50％的(X1)z为A，Z为5至30之间的整数；X2为S或G；X3为G或E；X4为G、S或N；X5为Q或Y；X6为G或S；X7为P或R；X8为Y或Q；X9为G或S；并且X10为S或G。15.权利要求1所述的组合物，其中所述重复区具有如SEQIDNO：33所示的氨基酸序列：(X1)ZX2SGPX3GGYGX4PX5QGPX6GGYGP其中X1独立地在每种情况下为A或G，其中至少50％的(X1)z为A，Z为5至30之间的整数；X2为S-G或不存在；X3为G-Q或不存在；X4为G或不存在；X5为S或G；X6为S-P、G-R或不存在。16.权利要求1所述的组合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·艾特塔禾，M·史梅，U·盖特，
申请(专利权)人：赛威克斯材料科学公司，
类型：发明
国别省市：以色列,IL