制备单倍体和随后的双单倍体植物的方法技术

据发现包含修饰的CENPC蛋白(包含一个或多个活性突变，其影响CENPC蛋白发挥功能但仍允许表达所述修饰的CENPC蛋白的植物存活)的植物能够在与包含内源性CENPC蛋白的野生型植物杂交之后诱导单倍体后代。本发明专利技术涉及单倍体和双单倍体植物的产生。

Methods for preparing haploid and subsequent haploid plants

Plants that contain modified CENPC protein (including one or more active mutations that affect CENPC protein function but still allow plant survival of the modified CENPC protein) can be induced to induce monploid offspring after hybridization with wild type plants containing endogenous CENPC proteins. The invention relates to the generation of haploid and haploid plants.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备单倍体和随后的双单倍体植物的方法专利
本公开涉及农业领域。特别地，本公开涉及制备单倍体和随后的双单倍体植物。专利技术背景育种材料中的高度杂合性可以使对有益性状的植物育种和选择成为非常耗时的过程。即使用最新的分子育种工具，大量的群体筛选也是费力和昂贵的。产生单倍体植物然后化学或自发基因组加倍是解决高杂合性问题的有效方式。这类双单倍体避开至少7代自交，否则需要降低杂合性至可接受的水平。可以通过小孢子培养在一些作物中产生单倍体植物。但是，这是昂贵和耗时的。更重要的是，在许多作物中，小孢子培养方法不可行。在一些作物物种中，可以通过卵细胞的孤雌生殖或通过消除亲代基因组之一获得(双)单倍体植物。但是，这些方法也局限于一些选定的作物，并且双单倍体植物的产率低。WO2011/044132公开了制备单倍体植物的方法。采用的方法之一是失活或敲除CenH3蛋白。这通过添加N-末端GFP至CenH3蛋白进行，从而产生GFP-CenH3。这也称作“尾部交换”。在与没有这样修饰的N-末端部分的CenH3蛋白的植物杂交时尾部交换足以诱导单亲基因组消除。单亲基因组消除导致产生单倍体植物。到目前为止这种方法仅在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中证实，并未在作物中证实。此外，当将由不同转基因修饰的N-末端部分的CenH3蛋白组成的另一人工构建体引入具有缺少内源性CenH3的遗传背景的植物时，看来这并未导致单亲基因组消除以及随后产生单倍体植物(WO2014/110274)。因此难以捉摸CenH3蛋白的哪个修饰对于单亲基因组消除是足够的。因此，本领域需要允许高效产生随后可以加倍的单倍体植物的方法，以便产生双单倍体植物。用双单倍体制备系统，在一代中实现纯和性。专利技术概述本专利技术人现在已发现由于独特的单核苷酸多态性，具有修饰的CENPC蛋白的植物在与缺少这些特定的独特的单核苷酸多态性的野生型植物杂交时能够诱导单倍体后代。一种多态性包含单一植物中的4个核苷酸改变，导致：(1)CENPC基因组DNA序列的剪接受体位点的G至T核苷酸修饰，导致在CENPC蛋白中插入H氨基酸，(2)CENPC蛋白中的D至K氨基酸修饰，以及(3)CENPC蛋白中的N至Y氨基酸修饰。另一独特的单核苷酸多态性导致CENPC蛋白中的M-V氨基酸修饰。用对照植物相互杂交，从未产生任何单倍体后代。本专利技术涉及包含一个或多个活性突变的植物来源的CENPC蛋白。所述一个或多个活性突变可以存在于包含SEQIDNO:2、3、4或15-19中任一个的氨基酸序列的蛋白中。可以在蛋白中产生所述一个或多个活性突变，所述蛋白包含SEQIDNO:2、3、4或15-19中任一个或其变体的氨基酸序列，所述变体与SEQIDNO:2、3、4或15-19中任一个的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性。在实施方案中，所述一个或多个活性突变存在于如SEQIDNO:5或6中任一个所示的氨基酸序列表示的双单倍体诱导结构域中。所述一个或多个活性突变可以选自：在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列中，位置552和553的氨基酸残基之间的突变，位置554的氨基酸残基的突变，位置555的氨基酸残基的突变以及位置556的氨基酸残基的突变，或者它们的任何组合；或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中，位置555和556的氨基酸残基之间的突变，位置557的氨基酸残基的突变，位置558的氨基酸残基的突变以及位置559的氨基酸残基的突变，或者它们的任何组合。在实施方案中，在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置554或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置557被突变的氨基酸是天冬氨酸和/或在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置555或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置558被改变的氨基酸是天冬酰胺和/或在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置556或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置559被改变的氨基酸是甲硫氨酸。在实施方案中，在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置554或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置557的氨基酸变为带正电荷的氨基酸残基，优选赖氨酸，和/或在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置555或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置558的氨基酸变为酪氨酸，和/或在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置556或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置557的氨基酸变为缬氨酸，和/或其中将带正电荷的残基，优选组氨酸插入SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的氨基酸残基552和553之间或者SEQIDNO:2的氨基酸序列中氨基酸残基555和556之间。在实施方案中，将组氨酸插入SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的氨基酸残基552和553之间或者SEQIDNO:2的氨基酸序列中氨基酸残基555和556之间，和/或将在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置554或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置557的天冬氨酸变为赖氨酸，和/或将在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置555或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置558的天冬酰胺变为酪氨酸。在实施方案中，所述蛋白包含SEQIDNO:8或SEQIDNO:10的氨基酸序列。所述蛋白可以由包含SEQIDNO:7或12中任一个的核酸序列的多核苷酸编码，或是所述蛋白可以由包含SEQIDNO:9或13中任一个的核酸序列的多核苷酸编码。在一实施方案中，所述蛋白由具有活性突变的CENPC蛋白编码多核苷酸编码，当存在于没有其内源性CENPC蛋白编码多核苷酸和/或内源性CENPC蛋白的植物中时，其允许所述植物存活，并且当所述植物与野生型植物杂交时，允许产生一些单倍体子代，或者具有异常倍性的子代。优选地，所产生的子代的至少0.1、0.5、1或5％是单倍体或具有异常倍性。所述蛋白可以通过利用靶向核苷酸交换或应用内切核酸酶在编码所述内源性CENPC蛋白的多核苷酸中引入突变衍生自内源性CENPC蛋白。在实施方案中，所述一个或多个活性突变不存在于包含SEQIDNO:1中示出的氨基酸序列的蛋白结构域中。在另一方面，本专利技术涉及编码如本文教导的CENPC蛋白的多核苷酸。本专利技术还涉及包含SEQIDNO:11或14中任一个或其变体的核酸序列的多核苷酸，所述变体与SEQIDNO:11或14中任一个的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性，但是其中在SEQIDNO:11的核酸序列的位置2449-2450和/或2454-2462或者在SEQIDNO:14的位置1660-1668的一个或多个核苷酸经修饰，从而所述核酸编码CENPC蛋白，其中SEQIDNO:3的氨基酸序列在位置554和/或在位置555和/或在位置556具有改变的残基，和/或在SEQIDNO:3的氨基酸序列的氨基酸残基552和553之间具有氨基酸残基如组氨酸的插入。此外，本文教导包含SEQIDNO:7或12中任一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含一个或多个活性突变的植物来源的CENPC蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.02 NL 20155521.包含一个或多个活性突变的植物来源的CENPC蛋白。2.权利要求1的CENPC蛋白，其中所述一个或多个活性突变存在于包含SEQIDNO:2、3、4或15-19中任一个的氨基酸序列的蛋白质中。3.权利要求2的CENPC蛋白，其中在蛋白质中产生所述一个或多个活性突变，所述蛋白质包含SEQIDNO:2、3、4或15-19中任一个或其变体的氨基酸序列，所述变体与SEQIDNO:2、3、4或15-19中任一个的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％或99％序列相同性。4.前述权利要求中任一项的CENPC蛋白，其中所述一个或多个活性突变存在于SEQIDNO:5或6中任一个所示的氨基酸序列所表示的双单倍体诱导结构域中。5.前述权利要求中任一项的CENPC蛋白，其中所述一个或多个活性突变选自：在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列中，位置552和553的氨基酸残基之间的突变，位置554的氨基酸残基的突变，位置555的氨基酸残基的突变以及位置556的氨基酸残基的突变，或者它们的任何组合；或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中，位置555和556的氨基酸残基之间的突变，位置557的氨基酸残基的突变，位置558的氨基酸残基的突变以及位置559的氨基酸残基的突变，或者它们的任何组合。6.权利要求5的CENPC蛋白，其中在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置554或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置557被突变的氨基酸是天冬氨酸和/或在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置555或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置558被改变的氨基酸是天冬酰胺和/或在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置556或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置559被改变的氨基酸是甲硫氨酸。7.权利要求5或6中任一项的CENPC蛋白，其中在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置554或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置557的氨基酸变为带正电荷的氨基酸残基，优选赖氨酸，和/或在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置555或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置558的氨基酸变为酪氨酸，和/或在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置556或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置557的氨基酸变为缬氨酸，和/或其中在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的氨基酸残基552和553之间或者SEQIDNO:2的氨基酸序列中氨基酸残基555和556之间插入带正电荷的残基，优选组氨酸。8.权利要求5-7中任一项的CENPC蛋白，其中在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的氨基酸残基552和553之间或者SEQIDNO:2的氨基酸序列中氨基酸残基555和556之间插入组氨酸，和/或在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置554或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置557的天冬氨酸变为赖氨酸，和/或在SEQIDNO:3或4中任一个的氨基酸序列的位置555或者在SEQIDNO:2的氨基酸序列中的位置558的天冬酰胺变为酪氨酸。9.权利要求8的CENPC蛋白，其包含SEQIDNO:8的氨基酸序列。10.权利要求9的CENPC蛋白，其由包含SEQIDNO:7或12中任一个的核酸序列的多核苷酸编码。11.权利要求7的CENPC蛋白，其包含SEQIDNO:10的氨基酸序列。12.权利要求11的CENPC蛋白，其由包含SEQIDNO:9或13中任一个的核酸序列的多核苷酸编码。13.前述权利要求中任一项的CENPC蛋白，其由具有活性突变的CENPC蛋白编码多核苷酸编码，当存在于没有其内源性CENPC蛋白编码多核苷酸和/或内源性CENPC蛋白的植物中时，其允许所述植物存活，并且当所述植物与野生型植物杂交时，允许产生一些单倍体子代，或者具有异常倍性的子代。14.权利要求13的CENPC蛋白，其中所产生的子代的至少0.1、0.5、1或5％是单倍体或具有异常倍性。15.前述权利要求中任一项的CENPC蛋白，其衍生自内源性CENPC蛋白，所述衍生通过利用靶向性核苷酸交换或应用内切核酸酶在编码所述内源性CENPC蛋白的多核苷酸中引入突变进行。16.权利要求1的CENPC蛋白，其中所述一个或多个活性突变不存在于包含SEQIDNO:1中示出的氨基酸序列的蛋白质结构域中。17.编码前述权利要求中任一项的CENPC蛋白的多核苷酸。18.包含SEQIDNO:11或14中任一个或其变体的核酸序列的多核苷酸，所述变体与SEQIDNO:11或14中任一个的氨基酸序列具有至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·H·M·奥普德恩坎普，P·J·范戴克，A·加勒德，
申请(专利权)人：主基因有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL