降低脱靶效应的CRISPR酶突变制造技术

在此披露并且要求保护CRISPR酶、例如Cas酶比如Cas9的一个或多个突变或一种或多种修饰，这些突变或修饰就含有或包括这样的经突变或修饰的Cas或CRISPR酶或Cas9的CRISPR‑Cas或CRISPR酶或者CRISPR‑Cas9系统或复合物的脱靶效应而言获得改进，例如降低脱靶效应。还披露并且要求保护用于制备和使用这样的含有这些突变或修饰的经突变或修饰的Cas或CRISPR酶或Cas9和系统或复合物的方法和这样的含有这些突变或修饰的经突变或修饰的Cas或CRISPR酶或Cas9和系统或复合物的用途以及来自这样的方法和用途的产物。

CRISPR enzyme mutation to reduce the Miss effect

One or more mutations or one or more modifications of the CRISPR enzyme, such as the Cas enzyme such as Cas9, are disclosed and required to contain or include such a mutation or modified Cas or CRISPR enzyme or the CRISPR Cas or CRISPR enzyme of Cas9 or the Miss effect of Cas9 system or complex of CRISPR. Improvement, for example, reduces the Miss effect. It also discloses and requires protection for the preparation and use of such mutations or modifications that have mutated or modified Cas or CRISPR enzymes or Cas9 and systems or complexes, and such mutations or modified Cas or CRISPR enzymes or Cas9 and systems or complexes and the use of such mutations or modifications as well as from such parties. The product of law and use.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】降低脱靶效应的CRISPR酶突变交叉引用/通过引用并入参考提交于2015年6月18日的美国临时申请序列号62/181,453，提交于2015年8月19日的美国临时申请序列号62/207,312，提交于2015年10月5日的美国临时申请序列号62/237,360，提交于2015年11月13日的美国临时申请序列号62/255,256以及提交于2015年12月18日的美国临时申请序列号62/269,876。前述一个或多个申请以及在本文中引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、以及在本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，连同针对在本文中提及或通过引用结合在本文中的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文，并且可以在本专利技术的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。关于联邦资助研究的声明本专利技术是根据由美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的授权号MH100706和MH110049在美国政府支持下完成的。美国政府享有本专利技术的某些权利。专利
本专利技术总体上涉及规律间隔成簇短回文重复(CRISPR)、CRISPR酶(例如，Cas或Cas9)、CRISPR-Cas或CRISPR系统或CRISPR-Cas复合物、其组分、核酸分子(例如，包括它的载体)以及前述所有项的用途等方面。专利技术背景如何在真核细胞中制备和使用CRISPR-Cas系统的授权披露的首发公开是丛(Cong)等人，《科学》(Science)2013；339:819-823(在线公开于2013年1月3日)。如何在真核细胞中制备和使用CRISPR-Cas系统的授权披露的首发专利申请是提交于2012年12月12日的张(Zhang)等人的美国临时申请序列号61/736,527，许多专利申请要求该临时申请的优先权，包括已经发展成为对未来有影响的美国专利号8,999,641、8,993,233、8,945,839、8,932,814、8,906,616、8,895,308、8,889,418、8,889,356、8,871,445、8,865,406、8,795,965、8,771,945和8,697,359的那些。专利技术概述与提供了使得能够在真核细胞中使用CRISPR-Cas系统的突破性进展一致，博德研究所(BroadInstitute)的张(Zhang)等人的实验室意识到仍需要改进的CRISPR酶，该酶用于在实现对靶座位的修饰中使用但是降低或消除朝向脱靶的活性。迫切需要用于降低CRISPR酶当与指导RNA复合时的脱靶活性的替代且稳健的系统和技术。还迫切需要用于增加CRISPR酶当与指导RNA复合时的活性的替代且稳健的系统和技术。已经开发了若干增强Cas9特异性的策略，包括减少细胞中的Cas9量、使用Cas9切口酶突变体产生一对并列的单链DNA切口、截短5'端的指导序列、以及使用一对各自融合至FokI核酸酶结构域的无催化活性的Cas9核酸酶。诸位专利技术人已经出人意料地确定，可以对CRISPR酶做出修饰，这些经修饰的CRISPR酶相比于未修饰的CRISPR酶赋予降低的脱靶活性和/或相比于未修饰的CRISPR酶赋予增加的靶标活性。因此，本文提供了可以在范围广泛的基因修饰应用中具有效用的改进的CRISPR酶。本文还提供了CRISPR复合物、组合物和系统，连同方法和用途，全部都包含本文披露的修饰的CRISPR酶。CRISPR-Cas9是优选的，包括但不限于SaCas9、SpCas9和直向同源物。在一个方面，提供了工程化的CRISPR蛋白，其中该蛋白与包含RNA的核酸分子复合以形成CRISPR复合物，其中当在该CRISPR复合物中时，该核酸分子靶向一个或多个靶多核苷酸座位，该蛋白相比于未修饰的CRISPR包括至少一种修饰，并且其中包含经修饰蛋白的CRISPR复合物相比于包含未修饰的CRISPR蛋白的复合物具有改变的活性。CRISPR-Cas9是优选的，包括但不限于SaCas9、SpCas9和直向同源物。CRISPR蛋白包括具有酶活性(例如核酸酶活性)的那些。在一个方面，该工程化的CRISPR蛋白的改变的活性包括就包含RNA的核酸分子或靶多核苷酸座位而言的改变的结合特性、就包含RNA的核酸分子或靶多核苷酸座位而言的改变的结合动力学、或就包含RNA的核酸分子或靶多核苷酸座位(相比于脱靶多核苷酸座位)而言的改变的结合特异性。在某些实施例中，该工程化的CRISPR蛋白的改变的活性包括增加的靶向效率或减少的脱靶结合。在某些实施例中，该工程化的CRISPR蛋白的改变的活性包括修饰的切割活性。在某些实施例中，改变的活性包括就靶多核苷酸座位而言的增加的切割活性。在某些实施例中，改变的活性包括就靶多核苷酸座位而言的降低的切割活性。在某些实施例中，改变的活性包括就脱靶多核苷酸座位而言的降低的切割活性。在某些实施例中，改变的活性包括就脱靶多核苷酸座位而言的增加的切割活性。因此，在某些实施例中，与脱靶多核苷酸座位相比，对靶多核苷酸座位有增加的特异性。在其他实施例中，与脱靶多核苷酸座位相比，对靶多核苷酸座位有降低的特异性。在本专利技术的一个方面，该工程化的CRISPR蛋白的改变的活性包括改变的解旋酶动力学。在本专利技术的一个方面，该工程化的CRISPR蛋白包含修饰，该修饰改变该蛋白与包含RNA的核酸分子、或靶多核苷酸座位的链、或脱靶多核苷酸座位的链的缔合。在本专利技术的一个方面，该工程化的CRISPR蛋白包含改变CRISPR复合物形成的修饰。本专利技术提供了：非天然存在的CRISPR酶，其中该酶与指导RNA复合以形成CRISPR复合物，当在该CRISPR复合物中时，该指导RNA靶向一个或多个靶多核苷酸座位并且该酶改变这些多核苷酸座位，并且该酶包括至少一种修饰，由此与未修饰的酶相比该CRISPR复合物中的酶具有降低的修饰一个或多个脱靶座位的能力，和/或由此与未修饰的酶相比该CRISPR复合物中的酶具有增加的修饰一个或多个靶座位的能力。在任何这样的非天然存在的CRISPR酶中，修饰可以包括该酶的一个或多个氨基酸残基的修饰。在任何这样的非天然存在的CRISPR酶中，修饰可以包括位于区域中的一个或多个氨基酸残基的修饰，该区域包含在未修饰的酶中带正电的残基。在任何这样的非天然存在的CRISPR酶中，修饰可以包括一个或多个氨基酸残基的修饰，这些氨基酸残基在未修饰的酶中是带正电的。在任何这样的非天然存在的CRISPR酶中，修饰可以包括一个或多个氨基酸残基的修饰，这些氨基酸残基在未修饰的酶中是不带正电的。修饰可以包括一个或多个氨基酸残基的修饰，这些氨基酸残基在未修饰的酶中是不带电的。修饰可以包括一个或多个氨基酸残基的修饰，这些氨基酸残基在未修饰的酶中是带负电的。修饰可以包括一个或多个氨基酸残基的修饰，这些氨基酸残基在未修饰的酶中是疏水的。修饰可以包括一个或多个氨基酸残基的修饰，这些氨基酸残基在未修饰的酶中是极性的。在任何以上描述的非天然存在的CRISPR酶中，该酶可以包括II型CRISPR酶。该酶可以包括Cas9酶。在某些以上描述的非天然存在的CRISP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化的CRISPR蛋白，其中：该蛋白与包含RNA的核酸分子复合，以形成CRISPR复合物，其中当在该CRISPR复合物中时，该核酸分子靶向一个或多个靶多核苷酸座位该蛋白与未修饰的蛋白相比包括至少一种修饰，其中与包含未修饰的蛋白的复合物相比，包含经修饰的蛋白的CRISPR复合物具有改变的活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.18 US 62/181,453;2015.08.19 US 62/207,312;1.一种工程化的CRISPR蛋白，其中：该蛋白与包含RNA的核酸分子复合，以形成CRISPR复合物，其中当在该CRISPR复合物中时，该核酸分子靶向一个或多个靶多核苷酸座位该蛋白与未修饰的蛋白相比包括至少一种修饰，其中与包含未修饰的蛋白的复合物相比，包含经修饰的蛋白的CRISPR复合物具有改变的活性。2.如权利要求1所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该改变的活性包括就该包含RNA的核酸分子或这些靶多核苷酸座位而言的改变的结合特性、就该包含RNA的核酸分子或这些靶多核苷酸座位而言的改变的结合动力学、或就该包含RNA的核酸分子或这些靶多核苷酸座位而言相比于脱靶多核苷酸座位的改变的结合特异性。3.如权利要求1或2所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该改变的活性包括增加的靶向效率或降低的脱靶结合。4.如权利要求1至3中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该改变的活性包括修饰的切割活性。5.如权利要求4所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰的切割活性包括就这些靶多核苷酸座位而言的增加的切割活性。6.如权利要求4所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰的切割活性包括就这些靶多核苷酸座位而言的降低的切割活性。7.如权利要求4至6中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰的切割活性包括就脱靶多核苷酸座位而言的降低的切割活性。8.如权利要求4至6中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰的切割活性包括就脱靶多核苷酸座位而言的增加的切割活性。9.如前述权利要求中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该改变的活性包括改变的解旋酶动力学。10.如前述权利要求中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该经修饰的CRISPR蛋白包含修饰，该修饰改变该蛋白与该包含RNA的核酸分子、或这些靶多核苷酸座位的链、或脱靶多核苷酸座位的链的缔合。11.如前述权利要求中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该经修饰的CRISPR蛋白包含修饰，该修饰改变该CRISPR复合物的形成。12.如前述权利要求中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该经修饰的CRISPR蛋白包含修饰，该修饰改变该核酸分子至这些多核苷酸座位的靶向。13.如权利要求10至12中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰包括该蛋白的与该核酸分子缔合的区域中的突变。14.如权利要求10至12中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰包括该蛋白的与这些靶多核苷酸座位的链缔合的区域中的突变。15.如权利要求10至12中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰包括该蛋白的与这些脱靶多核苷酸座位的链缔合的区域中的突变。16.如权利要求10至15中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括该蛋白的与该包含RNA的核酸分子、或这些靶多核苷酸座位的链、或脱靶多核苷酸座位的链缔合的区域中的减少的正电荷。17.如权利要求10至15中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括该蛋白的与该包含RNA的核酸分子、或这些靶多核苷酸座位的链、或脱靶多核苷酸座位的链缔合的区域中的减少的负电荷。18.如权利要求10至15中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括该蛋白的与该包含RNA的核酸分子、或这些靶多核苷酸座位的链、或脱靶多核苷酸座位的链缔合的区域中的增加的正电荷。19.如权利要求10至15中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括该蛋白的与该包含RNA的核酸分子、或这些靶多核苷酸座位的链、或脱靶多核苷酸座位的链缔合的区域中的增加的负电荷。20.如权利要求10至19中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变增加该蛋白与该包含RNA的核酸分子、或这些靶多核苷酸座位的链、或脱靶多核苷酸座位的链之间的位阻。21.如权利要求10至19中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括Lys、His、Arg、Glu、Asp、Ser、Gly、或Thr的取代。22.如权利要求10至19中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括用Gly、Ala、Ile、Glu、或Asp进行取代。23.如权利要求10至19中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括在结合沟槽中的氨基酸取代。24.如权利要求10至19中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该结合沟槽是在RuvC与HNH结构域之间。25.如权利要求10至19中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括RuvCI、RuvCIII、RuvCIII或HNH结构域中的突变。26.如权利要求10至19中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括在位置12、13、63、415、610、775、779、780、810、832、848、855、861、862、866、961、968、974、976、982、983、1000、1003、1014、1047、1060、1107、1108、1109、1114、1129、1240、1289、1296、1297、1300、1311、和1325中的一个或多个处的氨基酸取代，参考SpCas9的氨基酸位置编号。27.如权利要求26所述的工程化的CRISPR蛋白，其中在位置63、415、775、779、780、810、832、848、855、861、862、866、961、968、974、976、982、983、1000、1003、1014、1047、1060、1107、1108、1109、1114、1129、1240、1289、1296、1297、1300、1311、或1325处的修饰或突变包括丙氨酸取代。28.如权利要求26所述的工程化的CRISPR蛋白，其中在位置12处的修饰或突变包括天冬氨酸取代。29.如权利要求26所述的工程化的CRISPR蛋白，其中在位置13处的修饰或突变包括异亮氨酸取代。30.如权利要求26所述的工程化的CRISPR蛋白，其中在位置610处的修饰或突变包括甘氨酸取代。31.如权利要求26所述的工程化的CRISPR蛋白，其中在位置799处的修饰或突变包括亮氨酸取代。32.如权利要求26所述的工程化的CRISPR蛋白，其中在位置1129处的修饰或突变包括谷氨酸取代。33.如权利要求26所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括K775A、E779L、Q807A、R780A、K810A、R832A、K848A、K855A、K862A、K961A、K968A、K974A、R976A、H983A、K1000A、K1014A、K1047A、K1060A、K1003A、S1109A、H1240A、K1289A、K1296A、H1297A、K1300A、H1311A、或K1325A。34.如权利要求26所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括R783A和A1322T、或R780A和K810A、或R780A和K855A、或R780A和R976A、或K848A和R976A、或K855A和R976A、或R780A和K848A、或K810A和K848A、或K848A和K855A、或K810A和K855A、或H982A和R1060A、或H982A和R1003A、或K1003A和R1060A、或R780A和H982A、或K810A和H982A、或K848A和H982A、或K855A和H982A、或R780A和K1003A、或K810A和R1003A、或K848A和K1003A、或K848A和K1007A、或R780A和R1060A、或K810A和R1060A、或K848A和R1060A、或R780A和R1114A、或K848A和R1114A、或R63A和K855A、或R63A和H982A、或H415A和R780A、或H415A和K848A、或K848A和E1108A、或K810A和K1003A、或R780A和R1060A、或K810A和R1060A、或K848A和R1060A。35.如权利要求26所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括H982A、K1003A和K1129E，或R780A、K1003A和R1060A，或K810A、K1003A和R1060A，或K848A、K1003A和R1060A，或K855A、K1003A和R1060A，或H982A、K1003A和R1060A，或R63A、K848A和R1060A，或T13I、R63A和K810A，或G12D、R63A和R1060A。36.如权利要求26所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该修饰或突变包括R63A、E610G、K855A和R1060A，或R63A、K855A、R1060A和E610G。37.如前述权利要求中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该蛋白包括II型CRISPR蛋白。38.如前述权利要求中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该CRISPR蛋白包括来自以下属的生物的CRISPR蛋白，该属包括链球菌属、弯曲杆菌属、Nitratifractor、葡萄球菌属、细小棒菌属、罗氏菌属、奈瑟菌属、葡糖醋杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、乳杆菌属、真杆菌属或棒状杆菌属。39.如前述权利要求中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该蛋白包括Cas9蛋白。40.如前述权利要求中任一项所述的工程化的CRISPR蛋白，其中该CRISPR蛋白包括嵌合Cas9蛋白，该嵌合Cas9蛋白包含来自第一Cas9直向同源物的第一片段和来自第二Cas9直向同源物的第二片段，并且该第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：张锋，高林译，B·蔡澈，I·斯雷梅克，
申请(专利权)人：布罗德研究所有限公司，麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：美国,US