优化编码工程改造的流感蛋白的核苷酸序列的方法技术

本公开内容提供了用于产生编码工程改造的流感结构蛋白的优化的核苷酸序列的方法，和从其获得的优化的核苷酸序列。所述优化的核苷酸序列可在反求遗传学系统中用于促进包含工程改造的结构蛋白的传染性流感病毒的拯救和/或提高病毒效价。还提供了使用优化的核苷酸序列制备流感疫苗组合物的方法，以及使用流感疫苗组合物诱导免疫反应的方法。

Method for optimizing nucleotide sequence of influenza protein modified by coding Engineering

The present disclosure provides a method for optimizing nucleotide sequences for producing influenza structural proteins in coding engineering, and the optimized nucleotide sequence obtained from it. The optimized nucleotide sequences can be used in the reverse genetics system to promote the rescue and / or increase the viral titer of the infectious influenza virus containing engineered structural proteins. A method for preparing influenza vaccine compositions using an optimized nucleotide sequence is also provided, as well as a method of inducing an immune response using influenza vaccine composition.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】优化编码工程改造的流感蛋白的核苷酸序列的方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年6月9日提交的美国临时专利申请号62/172,949的权益，并依赖于其提交日，其整个公开内容通过引用结合到本文中。序列表本申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交和通过引用以其整体结合到本文中。所述ASCII副本，创建于2016年6月9日，名称为0171.0008-PCT_SL.txt，和大小为351,204字节。背景流感具有大流行、流行、再现和爆发的长的持续历史。疫苗已经是对流感最有效的防御。然而，年复一年设计和制造诱导毒株-特异性免疫的疫苗的工作已经是困难的，因为流感持续引起跨越全球的重大健康问题。认为年度流感流行在整个世界上每年产生3-5百万个严重疾病病例，和250,000-500,000例死亡。此外，当前上市的流感疫苗必须根据在即将来临的季节中在人群中将出现的预测毒株每年更新。流感病毒是正粘病毒科的成员。流感病毒存在三个亚型，称为流感A、流感B和流感C。流感病毒体包含分段的反义RNA基因组。在流感A病毒的情况下，RNA基因组编码以下蛋白：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质(Ml)、质子离子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白1(PBl)、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)和非结构蛋白2(NS2)。HA、NA、Ml和M2是膜相关蛋白，而NP、PBl、PB2、PA和NS2是核衣壳相关蛋白。Ml蛋白是在流感颗粒中最丰富的蛋白。HA和NA蛋白是被膜糖蛋白，负责病毒附着和病毒颗粒侵入细胞。特别地，HA将流感病毒结合至在它们的膜的表面结构上包含唾液酸的细胞。HA和NA蛋白二者是对于病毒中和以及保护性免疫的主要免疫显性表位的来源，使得它们是预防性流感疫苗的重要组分。流感病毒的产生和回收是在功能性流感疫苗候选物的评价中的重要步骤。负链RNA病毒例如流感病毒的反求遗传学，已经允许遗传操纵病毒基因组以产生新的病毒，其可用作活的减毒疫苗或表达异源蛋白的载体。反求遗传学技术允许产生完全来自克隆的病毒cDNA的传染性流感病毒(Fodor等,1999JVirol,73(11):9679-9682)。根据能够诱导表达8种vRNA和转录所需的至少聚合酶蛋白复合物和核蛋白(NP)的一组质粒，开发不同的系统。聚合酶蛋白复合物和NP也可通过4种另外的质粒的转染或通过使用含允许vRNA和mRNA二者分别通过RNA聚合酶I(POL1)和II(POL2)合成的双向启动子的质粒(Jackson等,2011,JGenVirol,92(Pt1):1-17)表达。转染的质粒的总数量可从16(Neuman等,1999,ProcNatlAcadSciUSA,96(16):9345-9350)或12(Fodor等,1999,JVirol,73(11):9679-9682)至8(Hoffmann等,2002,Vaccine,20(25-26):3165-3170)而改变，取决于策略是单向或双向，和从3(Neumann等,2005,ProcNatlAcadSciUSA,102(46):16825-16829)至1(Zhang等,2009,JVirol,83(18):9296-9303)而变化，如果质粒编码数个vRNA。最广泛使用的流感疫苗包含已被化学或物理灭活的病毒，或已被减毒的活病毒。这样的疫苗的实例是裂解的流感灭活疫苗(IIV)或活的减毒疫苗(LAIV)。制造这些疫苗通常需要在含胚鸡蛋中回收和繁殖疫苗病毒。然而，人流感的分离株在蛋中非常无效地生长，和分离的病毒经常需要通过一个过程进行适应，所述过程通常包括它们在蛋中的盲目传代和它们以高产量的实验室病毒的重配，以增加病毒/抗原产量。两种不同的技术可用于产生重配株流感病毒：经典重配和反求遗传学。流感A病毒的经典重配包括用疫苗病毒和高产量供体病毒(在大多数情况下为PR8)共-感染蛋。得到的重配株子代必须经过一个选择过程以鉴定具有合适的抗原组合和高产量生长表型的重配株病毒。该选择过程是麻烦的，不能保证将获得这样的重配株。与经典重配相反，反求遗传学得到具有预定义组合的基因或基因群的重配株病毒，不需要进一步选择。此外，反求遗传学可在缺少病毒分离株的情况下使用，和其是允许在疫苗病毒中引入靶基因修饰的唯一技术。事实上，反求遗传学在流感H5N1疫苗病毒的开发中已经是关键的，其中多-碱基切割位点必须从HA基因中除去。简述本专利技术的实施方案基于以下发现：包含天然不存在的工程改造的流感蛋白的流感疫苗病毒的产生，可仅通过反求遗传学实现。尽管大多数反求遗传学应用依赖于PCR或RT-PCR扩增来自预存在的病毒的模板，但DNA合成的最新进展允许在天然病毒模板不存在的情况下生产病毒。Wimmer等(2009)NatureBiotech.27(12):1163-1172;Wimmer等(2011)Annu.Rev.Microbiol.65:583-609。在流感病毒的情况下，使用合成的DNA和反求遗传学技术能够重建1918流感病毒(Tumpey等(2005)Science310:77-80.)和显示有希望加速响应于流感大流行的候选疫苗病毒的生产(Dormitzer等(2013)SciTrMed5(185):1-12;Verity等(2011)InfluenzaJ.101-109)。此外，候选疫苗病毒可包含经设计为比天然抗原更好的免疫原的合理工程改造的流感蛋白，例如公开于PCT/US2016/035594、WO2013/122827和美国公开号2015/0044247、2015/0017196、2014/0147459、2014/0127248和2013/0183342和美国临时申请62/345,502或62/344,862的工程改造的流感蛋白，其全部通过引用结合到本文中。使用反求遗传学和合成的DNA技术以生产表达工程改造的蛋白的流感病毒的一个重要的限制是需要编码这样的工程改造的蛋白的核苷酸序列。类似地，不能回收或拯救表达工程改造的蛋白的传染性流感病毒，可能部分地归因于缺少用于有效病毒包装的最佳序列的核苷酸序列。流感结构蛋白(例如，HA和NA)根据其特定的密码子使用，也可产生较高的病毒效价。增加的效价对于使病毒拯救的成功率最大化和在疫苗制造期间提高病毒产量，可能是重要的。本专利技术特别提供了产生编码工程改造的流感结构蛋白的优化的核苷酸序列的方法。还提供了使用优化的核苷酸序列以生产传染性流感病毒的方法，例如在反求遗传学系统中。在一些实施方案中，产生编码工程改造的流感结构蛋白的优化的核苷酸序列的方法包括：a)提供工程改造的流感结构蛋白的氨基酸序列；b)反向翻译氨基酸序列以产生第一核苷酸序列；c)鉴定第二核苷酸序列，其编码与工程改造的流感结构蛋白共有高度的序列同一性的流感结构蛋白；d)在第一和第二核苷酸序列中的密码子编码相同的氨基酸的每个位置处，改变第一核苷酸序列中的密码子以匹配来自第二核苷酸序列的密码子；和e)在第一和第二核苷酸序列中的密码子编码不同的氨基酸的每个位置处，改变第一核苷酸序列中的密码子以匹配基于结构蛋白-特异性流感密码子使用偏好的密码子，从而产生优化的核苷酸序列。在一些实施方案中，与工程改造的流感结本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.产生编码工程改造的流感结构蛋白的优化的核苷酸序列的方法，所述方法包括：a) 提供工程改造的流感结构蛋白的氨基酸序列；b) 反向翻译所述氨基酸序列以产生第一核苷酸序列；c) 鉴定第二核苷酸序列，其编码与所述工程改造的流感结构蛋白共有高度的序列同一性的流感结构蛋白；d) 在第一和第二核苷酸序列中的密码子编码相同的氨基酸的每个位置处，改变第一核苷酸序列中的密码子以匹配来自第二核苷酸序列的密码子；和e) 在第一和第二核苷酸序列中的密码子编码不同的氨基酸的每个位置处，改变第一核苷酸序列中的密码子以匹配基于结构蛋白‑特异性流感密码子使用偏好的密码子，从而产生优化的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.09 US 62/1729491.产生编码工程改造的流感结构蛋白的优化的核苷酸序列的方法，所述方法包括：a)提供工程改造的流感结构蛋白的氨基酸序列；b)反向翻译所述氨基酸序列以产生第一核苷酸序列；c)鉴定第二核苷酸序列，其编码与所述工程改造的流感结构蛋白共有高度的序列同一性的流感结构蛋白；d)在第一和第二核苷酸序列中的密码子编码相同的氨基酸的每个位置处，改变第一核苷酸序列中的密码子以匹配来自第二核苷酸序列的密码子；和e)在第一和第二核苷酸序列中的密码子编码不同的氨基酸的每个位置处，改变第一核苷酸序列中的密码子以匹配基于结构蛋白-特异性流感密码子使用偏好的密码子，从而产生优化的核苷酸序列。2.权利要求1的方法，其中与所述工程改造的流感结构蛋白共有高度的序列同一性的流感结构蛋白是野生型流感结构蛋白。3.权利要求1或2的方法，进一步包括添加来自高效价拯救毒株的5’和3’非编码序列至优化的核苷酸序列。4.权利要求3的方法，其中高效价拯救毒株是A/PuertoRico/8/34(PR8)。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中由所述优化的核苷酸序列编码的工程改造的流感结构蛋白的氨基酸序列与由第一核苷酸序列编码的氨基酸序列相同。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述优化的核苷酸序列进一步包含编码信号肽的核苷酸序列、编码跨膜结构域的核苷酸序列和/或编码胞质结构域的核苷酸序列。7.权利要求6的方法，进一步包括将所述优化的核苷酸序列中的编码信号肽的核苷酸序列交换为编码来自高效价拯救毒株的信号肽的核苷酸序列。8.权利要求6或7的方法，进一步包括将编码所述跨膜结构域的核苷酸序列交换为与编码来自高效价拯救毒株的跨膜结构域的核苷酸序列。9.权利要求6-8中任一项的方法，进一步包括将编码所述胞质结构域的核苷酸序列交换为编码来自高效价拯救毒株的胞质结构域的核苷酸序列。10.权利要求7-9中任一项的方法，其中高效价拯救毒株是A/PuertoRico/8/34(PR8)。11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述工程改造的流感结构蛋白是流感A型血凝素蛋白。12.权利要求11的方法，其中血凝素蛋白是选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17的亚型。13.前述权利要求中任一项的方法，其中结构蛋白-特异性流感密码子使用偏好描述于表1-10。14.前述权利要求中任一项的方法，其中反向翻译所述氨基酸序列以产生第一核苷酸序列包括使用对流感病毒特异性的密码子使用表。15.前述权利要求中任一项的方法，其中第二核苷酸序列编码野生型形式的流感结构蛋白，并且从包含流感核苷酸序列的公开可得的数据库鉴定。16.权利要求3的方法，其中5’非编码序列包含SEQIDNO:23的核苷酸序列和/或3’非编码序列包含SEQIDNO:24的核苷酸序列，或其中5’非编码序列包含SEQIDNO:103的核苷酸序列和/或3’非编码序列包含SEQIDNO:104的核苷酸序列。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：TD斯特鲁格内尔，G科特斯加西亚，T阿勒范蒂斯，
申请(专利权)人：圣诺菲·帕斯图尔公司，
类型：发明
国别省市：美国,US