卷曲螺旋连接体制造技术

连接第一和第二分子的螺旋状的卷曲螺旋型结构连接体，其中第一分子包含肽第一α‑螺旋且第二分子包含肽第二α‑螺旋，其中第二α‑螺旋卷曲到第一α‑螺旋；其中第一α‑螺旋包含i)由氨基酸基序a‑x1和C‑端基序a‑x1‑x2的重复组成的C‑端区域；或ii)由氨基酸基序x1‑a和N‑端基序x2‑x1‑a的重复组成的N‑端区域；其中a是4‑8个氨基酸的基序；x1是赖氨酸；和x2是基序的延长，其中延长由1‑10个氨基酸组成，其中延长不包含超过4个连续的氨基酸，连续的氨基酸掺入所述基序a‑x1或x1‑a中；和包含通过该连接体相互连接的至少两条多肽链的多聚体蛋白，其中第一多肽链掺入第一α‑螺旋且第二第一多肽链掺入第二α‑螺旋；并且其中第一和第二多肽链通过第一和第二α‑螺旋的螺旋状的卷曲螺旋型结构连接。

Spiral spiral connector

A spiral spiral structural connector connecting the first and second molecules, in which the first molecule contains a peptide first alpha spiral and the second molecule contains a peptide second alpha spiral, in which the second alpha helical spiral is curled to the first alpha spiral, and the first alpha spiral includes the I) and the amino acid sequence a X1 and C a X1 x2 The repetitive composition of the C terminus region; or II) the N a end region consisting of the amino acid sequence X1 A and the N x2 X1 a; a is the base order of the 4 amino acids; X1 is lysine; and X2 is the extension of the basic order, which extends by 1 amino acids and 10 amino acids, and the extension does not contain more than 4 consecutive amino acids. A continuous amino acid is added to the base sequence a X1 or X1 a; and contains at least two polypeptide chains linked through the connector, wherein the first polypeptide chain is added to the first alpha spiral and the first polypeptide chain is mixed with the second alpha spiral; and the first and more than 2 peptide chains are passed through the first and second alpha. A spiral spiral spiral structure.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】卷曲螺旋连接体
本专利技术涉及具有螺旋状的卷曲螺旋型结构的连接体(connector)，其包含形成卷曲螺旋的至少两个相匹配的肽α-螺旋，所述连接体通过添加末端氨基酸而得以改进。
技术介绍
在蛋白质中，卷曲螺旋由结构基序组成，其中2-7个α-螺旋像绳子一样卷曲在一起；二聚体和三聚体是最常见的类型。这种结构可以提高复合蛋白质分子的稳定性和折叠结构。卷曲螺旋已经被用于连接多聚体蛋白的组分或蛋白质构建体(特征在于一个或多个多肽链和任选其他的非多肽组分)，包括例如复合疫苗免疫原或抗体融合构建体。卷曲螺旋螺旋(coiledcoilhelices)已经被用于稳定Fv抗体片段，从而产生异源二聚体卷曲螺旋结构域(Arndtetal.2001.Helix-stabilizedFv(hsFv)antibodyfragments：substitutingtheconstantdomainsofaFabfragmentforaheterodimericcoiled-coildomain.JMol.Biol.312:221-228)。卷曲螺旋原理也用于纯化目的(例如，Chaoetal1998.Useofaheterodimericcoiled-coilsystemforbiosensorapplicationandaffinitypurification.J.Chromatogr.BBiomed.Sci.Appl.715:307-329)，以及用于将待测的蛋白质作为配体进行束缚(tethering)，例如生长因子受体(Boucheretal.2009，EpidermalGrowthFactorTetheredthroughCoiled-CoilInteractionsInducesCellSurfaceReceptorPhosphorylation.Bioconjug.Chem.1569-1577)。WO2014009209A2公开了一种疫苗，包含由免疫原和佐剂形成的卷曲螺旋，其中佐剂包含至少与TLR9配体连接的抗-CD32部分和第一肽α-螺旋，并且免疫原包含至少一个表位和与第一α-螺旋卷曲的第二肽α-螺旋。第一α-螺旋通常由(包含或由其组成)第一基序的多分体重复(polyadrepeat)组成。相匹配的第二α-螺旋(包含或由反基序的多分体重复组成)与第一α-螺旋自组装，因此形成卷曲螺旋，以高亲和力连接与每个α-螺旋融合的部分。US20150166610A1和WO2015018806A1描述了由C-端卷曲螺旋结构域稳定的免疫原性组合物。WO2015006736A2描述了一种融合蛋白，其中免疫球蛋白通过卷曲螺旋与治疗剂连接。WO94/293332A1描述了在分子内反平行卷曲螺旋茎环结构中构象相似的多肽。环片段包含在第一α-螺旋结构的羧基端和第二α-螺旋结构的氨基端之间的连接体。Richardson等人(Science1988,240:1648-1652)描述了在α螺旋的末端特定位置的氨基酸偏好。来自45个不同球状蛋白质结构的215个α螺旋的比较结果显示了在C-端或N-端位置处具体氨基酸的某种偏好。Serrano等人(JournalofMolecularBiology1992,227(2):544-559)描述了蛋白质中α-螺旋的稳定性以及N-端、C-端和内部位置上的突变对稳定性的影响。WO2014187743A1描述了胃泌素肽免疫原性组合物，其包含两种不同α-螺旋的卷曲螺旋。设计药剂(例如免疫原)时，复合蛋白质分子的稳定性和折叠结构至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有提高的稳定性和结构的卷曲螺旋连接体，其可以用作设计复合多肽或蛋白质的结构单元。本专利技术的目的通过所要求保护的主题来解决。根据本专利技术，提供了螺旋状的卷曲螺旋型结构的连接体，其包含第一和第二分子，特别地，其中第一和第二分子的每个是包含多肽部分或多肽链的蛋白质分子，其中第一分子包含肽第一α-螺旋(peptidicfirstalpha-helix)且第二分子包含肽第二α-螺旋，第二α-螺旋卷曲至第一α-螺旋；其中第一α-螺旋包含i)由氨基酸基序a-x1和C-端基序a-x1-x2的重复组成的C-端区域；或ii)由氨基酸基序x1-a和N-端基序x2-x1-a的重复组成的N-端区域；其中，a是4-8个氨基酸的基序序列；x1是赖氨酸；和x2是基序的延长，其中延长由1-10个氨基酸组成，并且其中延长不包含掺入所述基序a-x1或x1-a中的超过4个连续的氨基酸。具体地，延长的氨基酸是天然氨基酸。具体地，延长包含至少一个氨基酸，所述氨基酸选自由丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸组成的组。具体地，延长包含沿α-螺旋延长的前1-4个氨基酸内的所述选择的氨基酸，特别是(未延长的)α-螺旋的末端或帽。具体地，基序序列a由任何天然氨基酸的序列组成。优选地，基序序列包含至少一个疏水性氨基酸，以确保基序重复中的疏水残基周期性和α-螺旋倾向(propensity)。具体地，连接体包含卷曲的α-螺旋(即，α-螺旋的纵向组装)或由卷曲的α-螺旋组成。该连接体尤其用作连接两个相同结构分子(例如，以获得同源二聚体)或两个不同分子(例如，以获得异源二聚体)的结构单元。特别地，一个或两个分子是蛋白质，例如掺入多肽部分的蛋白质，多肽部分优选由多肽链组成，尤其是与连接体的α-螺旋(用作连接部分)融合的多肽链。具体地，所述第一和第二α-螺旋中的每一个包含2-9个相匹配的氨基酸基序的重复，优选为3-5个。在每个α-螺旋上可以存在相同数目的重复，但也可以是不同数目。例如，在每个肽α-螺旋中，螺旋重复的数目可以是3至5，即3+3、3+4、3+5、4+4、4+5、5+5、4+3、5+3或5+4的任一组合。具体地，重复是相同基序的重复，或是在至少一个氨基酸(通常为1或2个氨基酸)上彼此不同的基序的重复。可以使用基序的变体，只要这些变体基序是功能性的，即，其中α-螺旋能够以高亲和力自组装，例如KD小于10-7M或KD小于10-8M。在异源二聚体卷曲螺旋的情况中，螺旋重复的典型数目具体不超过5，以避免不希望的结构错配。在异源二聚体卷曲螺旋的情况中，通常需要使用具有至少3个重复的肽序列长度。因此，α-螺旋彼此的结合通常以KD小于10-7M或KD小于10-8M的高亲和力实现，优选小于10-9M或10-10。然而，虽然更多的重复增加了亲和力，但这可能以增加的同源二聚化(homodimerisation)为代价。具体地，所述第一和第二α-螺旋的每一个包含由6、7、8或9个氨基酸组成的氨基酸基序重复，优选7个氨基酸。这种基序也被称为多分体，因为它由许多连续的氨基酸组成，例如长度为6-9个氨基酸。通常使用7个氨基酸的基序，在此称为七肽。或者，可以使用六元(即6个氨基酸)基序、八元(即8个氨基酸)基序或九元(即9个氨基酸)基序。具体地，连接体包含在螺旋状的卷曲螺旋型结构中具有相匹配的氨基酸重复序列的2-7个α-螺旋的束(bundle)。根据具体的实施例，第一和第二α-螺旋被卷曲成卷曲螺旋的(换句话说，组装的)双螺旋。具有彼此卷曲的α-螺旋结构的两条肽链在本文中称为二聚体。具体的实例包括两个或更多个α本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种连接第一和第二分子的螺旋状的卷曲螺旋型结构的连接体，其中所述第一分子包含肽第一α‑螺旋且所述第二分子包含肽第二α‑螺旋，第二α‑螺旋卷曲到第一α‑螺旋；其中第一α‑螺旋包含i)由氨基酸基序a‑x1和C‑端基序a‑x1‑x2的重复组成的C‑端区域；或ii)由氨基酸基序x1‑a和N‑端基序x2‑x1‑a的重复组成的N端区域；其中，a是4‑8个氨基酸的基序序列；x1是赖氨酸；和x2是所述基序的延长，其中所述延长由1‑10个氨基酸组成，并且其中所述延长不包含超过4个连续的氨基酸，所述连续的氨基酸掺入所述基序a‑x1或x1‑a中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.01 EP 15183330.81.一种连接第一和第二分子的螺旋状的卷曲螺旋型结构的连接体，其中所述第一分子包含肽第一α-螺旋且所述第二分子包含肽第二α-螺旋，第二α-螺旋卷曲到第一α-螺旋；其中第一α-螺旋包含i)由氨基酸基序a-x1和C-端基序a-x1-x2的重复组成的C-端区域；或ii)由氨基酸基序x1-a和N-端基序x2-x1-a的重复组成的N端区域；其中，a是4-8个氨基酸的基序序列；x1是赖氨酸；和x2是所述基序的延长，其中所述延长由1-10个氨基酸组成，并且其中所述延长不包含超过4个连续的氨基酸，所述连续的氨基酸掺入所述基序a-x1或x1-a中。2.根据权利要求1所述的连接体，其中所述延长包含至少一种氨基酸，所述氨基酸选自由丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和脯氨酸组成的组。3.根据权利要求2所述的连接体，其中所述延长包含沿α-螺旋延长的前1-4个氨基酸内的所述选择的氨基酸。4.根据权利要求1-3中任一项所述的连接体，其中第一和第二α-螺旋中的每一个包含2-9个相匹配的氨基酸基序的重复，优选为3-5个，优选地，其中所述重复是相同基序的重复或在至少一个氨基酸上彼此不同的基序的重复。5.根据权利要求1-4中任一项所述的连接体，其包括在螺旋状的卷曲螺旋型结构中具有相匹配的氨基酸重复序列的2-7个α-螺旋的束。6.根据权利要求1-5中任一项所述的连接体，其中第一和第二α-螺旋是平行或反平行的α-螺旋，优选地，其中第一和第二α-螺旋卷曲成螺旋卷曲双螺旋。7.根据权利要求1-6中任一项所述的连接体，其包含异源二聚体卷曲螺旋，其中第一α-螺旋与第二α-螺旋不同。8.根据权利要求1-7中任一项所述的连接体，其中，a)基序a-x1选自由SEQID1、SEQID3、SEQID5和SEQID7组成的组；或b)基序x1-a选自由SEQID2、SEQID4、SEQID6和SEQID8组成的组。9.根据权利要求1-8中任一项所述的连接体，其中，a)基序a-x1是SEQID1且基序a-x1-x2是SEQID41、SEQID69或SEQID71中的任一个，基序a-x1-x2任选地由一个或多个氨基酸延长；或b)基序a-x1是SEQID3且基序a-x1-x2是SEQID43、SEQID85或SEQID87中的任一个，基序a-x1-x2任选地由一个或多个氨基酸延长；或c)基序a-x1是SEQID5且基序a-x1-x2是SEQID45、SEQID101或SEQID103中的任一个，基序a-x1-x2任选地由一个或多个氨基酸延长；或d)基序a-x1是SEQID7且基序a-x1-x2是SEQID47、SEQID117或SEQID119中的任一个，基序a-x1-x2任选地由一个或多个氨基酸延长；或e)基序x1-a是SEQID2且基序x2-x1-a是SEQID42、SEQID77或SEQID79中的任一个，基序x2-x1-a任选地由一个或多个氨基酸延长；或f)基序x1-a是SEQID4且基序x2-x1-a是SEQID44、SEQID93或SEQID95中的任一个，基序x2-x1-a任选地由一个或多个氨基酸延长；或g)基序x1-a是SEQID6且基序x2-x1-a是SEQID46、SEQID109或SEQID111中的任一个，基序x2-x1-a任选地由一个或多个氨基酸延长；或h)基序x1-a是SEQID8且基序x2-x1-a是SEQID48、SEQID125或SEQID127中的任一个，基序x2-x1-a任选地由一个或多个氨基酸延长。10.根据权利要求1-9中任一项所述的连接体，其中，a)第一α-螺旋包含基序a-x1且第二α-螺旋包含基序x1-a；或b)第一α-螺旋包含基序x1-a且第二α-螺旋包含基序a-x1；优选地，其中包含基序a-x1的α-螺旋还包含C-端基序a-x1-x2，且包含基序x1-a的α-螺旋还包含N-端基序x2-x1-a。11.根据权利要求9所述的连接体，其中，a)i)基序a-x1是SEQID1；ii)...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·穆德，J·塞普尔韦达，C·陶斯，L·穆德伯尔，
申请(专利权)人：安可QRML有限公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT