用于制备减毒四价登革热疫苗的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于制备减毒四价登革热疫苗的方法及其产品。本发明专利技术还涉及一种用于制备向受试者施用的四价登革热疫苗的方法，一种诱导受试者对登革热血清型1、2、3和4的免疫反应的方法以及一种四价登革热疫苗试剂盒。

A method for the preparation of detoxification detoxification dengue vaccine

The invention relates to a method for preparing an attenuated tetravalent dengue vaccine and a product thereof. The present invention also relates to a method for preparing a tetravalent dengue vaccine for subjects, a method of inducing immune responses to 1, 2, 3 and 4 of dengue fever type, and a tetravalent dengue vaccine kit.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备减毒四价登革热疫苗的方法并入序列表包含在2015年8月31日创建的56,450字节(在操作系统MS-Windows中测量的)的命名为“60135_146578_ST25.txt”的文件中的序列表以电子方式提交，并且通过引用整体合并于此。
本专利技术在生物
本专利技术涉及用于制备减毒四价登革热疫苗的方法。本专利技术还涉及减毒四价登登革热疫苗。本专利技术还涉及减毒四价登革热疫苗。本专利技术还涉及用于重组疫苗的组合物的使用。本专利技术还涉及诱导对患者血清型1、2、3和4的免疫反应的方法。本专利技术还涉及四价登革热疫苗试剂盒。
技术介绍
目前，登革热是一种对巴西公众健康有重大影响的疾病。它影响着生活在流行地区的一半的世界人口，主要集中在东南亚(太平洋地区)和美国。据WHO称，在最近的一项研究中，估计每年约有3.9亿登革热感染(95％可信区间284百万至528百万)，其中，9600万(67百万至136百万)在临床上表现出来(任何严重程度的疾病)[1]。在另一项有关登革热流行的研究中，估计128个国家的3900万人有登革热病毒感染的危险[2]。在巴西，2000年发病人数为20万登革热病例，2010年发生了100万例登革热病例。2015年，直到3月份，巴西报告的登革热病例有460502例。东南地区报告病例数最多(304251例，66.1％)，其次是中西部地区(59855例，13％)，东北地区(51221例，11.1％)，北方地区(19402例，2％)和南方(25773例，5.6％)[3]。登革热(DF)及其严重形式登革热出血热(DHF)/登革热休克综合症(DSS)会由登革热血清型DEN1、DEN2、DEN3和DEN4感染引起。由于目前没有治疗这种疾病的抗病毒药物，并且蚊媒(埃及伊蚊)控制策略已被证明无效，控制登革热进展的唯一方法是通过预防，使用针对四种登革热的疫苗病毒。目前，登革热疫苗尚未获得人类使用许可。流行病学研究表明，一种登革热血清型的原发感染通常会导致DF，而第二次感染导致DHF的机会比原发感染高15倍至80倍。因此，一种有效的登革热疫苗必须由四种血清型血清型登革热病毒组成[4]。然而，四价登革热疫苗的开发非常困难，因为该产品必须提供对所有登革热病毒血清型的长期保护[5]。2009年3月4日提交的美国专利申请13/305,639(专利号12/398,043的继续申请)、2004年10月21日提交的当前专利号8,075,903(作为申请号10/970,640的继续申请)、2003年4月25日提交的当前美国专利号7,517,531号(申请号PCT/US03/13279的继续申请)通过美国政府(由卫生和人类服务部门秘书代表)提交的标题为“登革热四价疫苗，其在登革热类型1、2、3和4或抗原嵌合登革热病毒1、2、3和4的3’中含有共同的30个核苷酸缺失”。上述专利是指从包含四种登革热病毒血清型和30个核苷酸缺失或抗原性嵌合登革热病毒的混合物中获得的一种产物。MonikaSimmons等人在2007年11月2日提交的美国专利申请11/982,488，在2012年5月31日被公开并在2012年8月14日被授权，标题为“使用初免-加强方法诱导针对登革热病毒的免疫反应”描述了用于诱导对登革热病毒的免疫反应的方法。诱导对登革热病毒的免疫反应的方法包括：施用非复制免疫原，接着用四价活的减毒病毒疫苗进行加强。另一方面是诱导免疫反应的方法，其使用含有DNA表达系统、腺病毒表达载体或委内瑞拉马脑炎病毒复制子系统的启动免疫原的异源初免-加强方案以及包含没有DNA表达系统的上述启动免疫原。每种表达系统含有编码登革热病毒蛋白的DNA序列。以上专利描述了登革热疫苗的免疫方案。在该方案中，第一次免疫使用非复制免疫原，并在四价活减毒登革热疫苗后使用。本专利申请的目的是获得减毒活登革热疫苗的方法。本专利技术教导了使用以下减毒病毒株来开发针对四种登革热病毒的疫苗：rDEN1Δ30-1545(SEQIDNO：1)及其变体；rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163(SEQIDNO：2)及其变体；rDEN3Δ30/31-7164(SEQIDNO：3)及其变体以及rDEN4Δ30-7132、7163、8308(SEQIDNO：4)及其变体。某些rDEN1Δ30，rDEN2/4Δ30，rDEN3Δ30和rDEN4Δ30重组减毒登革热病毒描述于美国专利号7,517,531、7,226,602和8,337,860，其全部内容在此引入作为参考。本专利技术中称为登革热疫苗1、2、3、4(减毒)的疫苗以冻干形式呈现在装有10个剂量的小瓶中。在开发这种疫苗时，建立了以下过程：产生Vero细胞和登革热病毒的血清型1、2、3和4以获得细胞和病毒库；用这些库的细胞和病毒生产病毒悬浮液；浓缩这些悬浮液和病毒体的制备；配制单价和四价疫苗；填充；冻干和密封产品。可以看出，没有一种现有技术文献公开或提出了一种能够大规模制备登革热疫苗的用于制备减毒四价登革热疫苗的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本公开将提供比现有制备四价登革疫苗的方法的显着的优点。最初，本专利技术的某些实施方案使用具有较低传代的Vero细胞株(第123代)，其允许该细胞系的大量传代培养，即高产量。此外，用维持在无血清培养基中的细胞制备Vero细胞主库和工作库，用非动物源胰蛋白酶传代培养，并用5％DMSO将其稳定。无血清培养基的使用导致更高的重复性，更不用说在Vero细胞的维持和扩增的次培养中使用非动物胰蛋白酶使得该方法更安全并且不可能使最终产品受猪圆环病毒污染。此外，Vero细胞可以在225cm2的TC培养瓶(组织培养瓶)或NuncTM细胞工厂系统TM中生长，其具有10个托盘层(美国宾夕法尼亚州匹兹堡的赛默飞世尔科技公司(赛默飞世尔科技公司，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国)；培养面积约6,320cm2)，其允许高达约2×109个细胞/CFS的细胞/TC瓶的高产量。在制备工作病毒种子库的Vero细胞中额外复制登革热病毒增加了处理的生产率。在CFS的一个生产周期中获得的病毒悬浮液的最终体积是14L(高体积)。在本专利技术的某些实施方案中，在病毒的单个生产周期中可以获得多达约七次收集。通过从培养物中除去含有病毒的培养基，用新鲜培养基代替被除去的培养基，用新培养基培养被感染的细胞，并在培养后收集含有病毒的培养基，从感染的细胞中收集登革热病毒悬浮液，这也增加本文提供的处理的生产率。本公开还教导了通过研究在TC培养瓶和细胞工厂系统TM中生长的Vero细胞中的血清型1、2、3和4的登革热病毒复制曲线来获得病毒悬浮液上清液的最佳时间，其允许增加收集的次数。在某些实施方案中，本公开内容的四价疫苗使用根据每种血清型含有不同滴度的病毒登革热的单价疫苗制备(对于DENV1、DENV2、DENV3和DENV4分别为5.7±0.2、5.6±0.2、6.1±0.2以及5.8±0.2Log10PFU/ml)，这使得四价疫苗中每种血清型的病毒颗粒具有更高的同质性。最后，要求保护的方法中的填充步骤和冻干步骤提供了在2℃至8℃下稳定1年的疫苗。总之，制备本申请的减毒四价登革热疫苗的方法呈现高收率且可再生。该疫苗是所述方法的产物，其高度稳定且没有通常用于疫苗的生产中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备减毒四价登革热疫苗的方法，其包括：(i)在培养物中扩增Vero细胞以产生Vero细胞的主库和工作库，其中，所述Vero细胞适于在无血清培养基中生长，并在无血清培养基中长成，并且用该细胞的非动物源的胰蛋白酶于225cm2组织培养(TC)烧瓶中并随后在细胞工厂系统TM(CFS)中传代培养；(ii)用来自每个病毒的种子或工作库的登革热病毒血清型1、2、3和4感染来自主库或工作库的Vero细胞，其中，所述Vero细胞独立地感染分别在具有无血清培养基培养物中的登革热病毒血清型1、2、3和4；(iii)在36.5℃(±1℃)下培育含有所述受每种登革热病毒感染的Vero细胞的225cm2TC烧瓶或细胞工厂系统TM(CFS)10天至20天；(iv)收集每种培养物的上清液；(v)通过具有0.2μm孔隙度的膜过滤来自步骤(iv)的每种登革热病毒悬浮液，并在‑80℃(±5℃)下存储该过滤后的登革热病毒；(vi)制备所述血清型1、2、3和4的登革热病毒体；(vii)配制单价疫苗；(viii)通过混合所述单价疫苗来配制所述四价疫苗；(ix)用所述四价疫苗填充小瓶；(x)将小瓶中所述的四价疫苗冻干；(xi)将所述冻干的四价疫苗密封在小瓶中；(xii)在2℃至8℃储存冻干密封产品，从而制备所述减毒四价登革热疫苗。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.08 US 14/847,4221.一种用于制备减毒四价登革热疫苗的方法，其包括：(i)在培养物中扩增Vero细胞以产生Vero细胞的主库和工作库，其中，所述Vero细胞适于在无血清培养基中生长，并在无血清培养基中长成，并且用该细胞的非动物源的胰蛋白酶于225cm2组织培养(TC)烧瓶中并随后在细胞工厂系统TM(CFS)中传代培养；(ii)用来自每个病毒的种子或工作库的登革热病毒血清型1、2、3和4感染来自主库或工作库的Vero细胞，其中，所述Vero细胞独立地感染分别在具有无血清培养基培养物中的登革热病毒血清型1、2、3和4；(iii)在36.5℃(±1℃)下培育含有所述受每种登革热病毒感染的Vero细胞的225cm2TC烧瓶或细胞工厂系统TM(CFS)10天至20天；(iv)收集每种培养物的上清液；(v)通过具有0.2μm孔隙度的膜过滤来自步骤(iv)的每种登革热病毒悬浮液，并在-80℃(±5℃)下存储该过滤后的登革热病毒；(vi)制备所述血清型1、2、3和4的登革热病毒体；(vii)配制单价疫苗；(viii)通过混合所述单价疫苗来配制所述四价疫苗；(ix)用所述四价疫苗填充小瓶；(x)将小瓶中所述的四价疫苗冻干；(xi)将所述冻干的四价疫苗密封在小瓶中；(xii)在2℃至8℃储存冻干密封产品，从而制备所述减毒四价登革热疫苗。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述上清液在步骤(iv)中收集，相同体积的无血清培养基被添加到所述培养物，并且步骤(iii)和(iv)被重复。3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(iii)和步骤(iv)重复约一次至七次。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所使用的登革热病毒株是rDEN1Δ30-1545(SEQIDNO：1)或其变体；rDEN2/4Δ30(ME)-1495，7163(SEQIDNO：2)或其变体；rDEN3Δ30/31-7164(SEQIDNO：3)或其变体以及rDEN4Δ30-7132，7163，8308(SEQIDNO：4)或其变体。5.一种用于制备减毒四价登革热疫苗的方法，其包括：(i)在培养物中扩增Vero细胞以产生Vero细胞的主库和工作库，其中，所述Vero细胞适于在无血清培养基中生长，并在无血清培养基中长成，并且用非动物源胰蛋白酶传代培养；(ii)用来自每种病毒的种子或工作库的登革热病毒血清型1、2、3和4感染来自所述主库或工作库的Vero细胞，其中，所述Vero细胞独立地感染分别在具有无血清培养基的培养物中的登革热病毒血清型1、2、3和4；(iii)在36.5℃(±1℃)下培育在组织培养烧瓶或细胞工厂系统TM中受每种登革热病毒感染的所述Vero细胞10天至...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·M·F·盖丽娜，
申请(专利权)人：布坦坦基金会，
类型：发明
国别省市：巴西,BR