新型抗人GPVI抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及人源化抗人GPVI抗体及其用途。

New anti human GPVI antibody and its use

The invention relates to humanized anti human GPVI antibodies and their uses.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型抗人GPVI抗体及其用途专利
本专利技术涉及新型抗人糖蛋白VI抗体以及其用于治疗心血管疾病的用途。专利技术背景急性冠状动脉和脑血管意外是目前世界上的主要死亡原因。此外，在急性冠状动脉综合征后的治疗后6个月周期中复发和死亡的全球发生率仍为8-15％。在具有ST段抬高的急性冠状动脉综合征的情况中，采用冠状动脉血管成形术和引入支架的机械治疗对于紧急恢复冠状动脉血流是高度有效的，但不能防止在接下来的6个月内约15％患者的发病率/死亡率。基于长期纤维蛋白溶解药物、抗凝药物和抗聚集药物联合的溶栓治疗给出甚至不太令人欣喜的结果。事实上，尽管血栓症的医学治疗有所改善，但6个月时的发病率/死亡率相似于无ST段抬高的急性冠状动脉综合征的观察结果。对于脑血管缺血事件，由于对大多数患者整体晚的医护以及目前可用的抗血栓症治疗的出血风险，治疗仍是非常有限的。因此临床上仍然需要改善对心血管疾病的治疗，特别是对于与现有分子相比具有改善特征的新分子。面临的挑战是获得对病理性血栓症具有优异功效但没有出血风险的分子。为了解决这种要求，靶标在患病血管中发生的血栓形成中必须发挥比在为限制健康血管出血所需的生理止血中更大的作用。血小板糖蛋白VI就是这种情况，已经证实其在动物的实验性血栓形成(包括中风、血管重塑)中起作用并且证实其在动脉粥样硬化血栓形成中至关重要。与目前在血栓形成治疗中使用的并抑制血小板最终活化阶段(即血小板聚集)的αIIbβ3整合素拮抗剂以及血小板募集拮抗剂(P2Y12ADP受体和阿司匹林的抑制剂)相反，GPVI牵涉到血小板栓形成的几个步骤：通过与受损血管壁相互作用的引发；通过初始血小板活化导致次级激动剂(secondaryagonists)的分泌、整合素和血小板促凝血活性的激活的扩张；经由与纤维蛋白相互作用的生长和稳定(Mammadovaetal.，Blood2015)。因此，GPVI拮抗剂不仅可以防止血小板聚集，还可以防止次级激动剂释放以及生长因子和细胞因子分泌，从而导致出现血管损害。最后，GPVI表达被限制于血小板和巨核细胞，并因此代表了抗血栓形成治疗的完美特异性靶标。GPVI拮抗剂因此被开发用于治疗心血管疾病。WO2001/000810和WO2003/008454均描述了可溶性GPVI重组蛋白，其是GPVI胞外结构域和人IgFc结构域之间的融合蛋白。这种可溶性重组GPVI蛋白与血小板GPVI竞争结合胶原蛋白。这种可溶性GPVI蛋白首先在血栓形成鼠模型中获得了令人欣喜的结果，但是这些结果未被证实。此外，这种方法涉及结构、功能和药理学缺点。首先，这种化合物是高分子量嵌合蛋白(～160kDa)。GPVI-Fc靶向在血管损伤部位暴露的胶原蛋白，其量和可接近性是难以预测的，因此，待注射的产品的量对GPVI-Fc的使用构成潜在的限制。另一个限制可能是对在融合蛋白上可能暴露的新表位免疫的风险。本领域还描述了针对人GPVI的中和性单克隆抗体。例如，EP1224942和EP1228768公开了特异性结合小鼠GPVI的大鼠单克隆抗GPVI抗体JAQ1，用于治疗血栓性疾病。JAQ1抗体诱导小鼠血小板上的GPVI受体不可逆内化。EP1538165描述了另一种大鼠单克隆抗GPVI抗体(hGP5C4)，发现其Fab片段对由胶原蛋白刺激诱导的血小板的主要生理功能具有明显的抑制作用：对胶原蛋白介导的生理活化标记物PAC-I和CD62P-选择素的刺激被hGP5C4Fab完全阻止，并且hGP5C4Fab离体时有效抑制人血小板聚集而没有任何内在活性。然而，5C4是一种大鼠抗体，因此仅具有非常有限的治疗潜力。WO2005/111083描述了4种小鼠单克隆抗GPVI抗体OM1、OM2、OM3和OM4，发现它们在体外抑制GPVI与胶原蛋白的结合、胶原蛋白诱导的分泌和血栓素A2(TXA2)的形成，以及静脉内注射到食蟹猴后离体时胶原蛋白诱导的血小板聚集。OM4还可以在大鼠血栓形成模型中抑制血栓形成。WO2001/000810还描述了命名为8M14.3、3F8.1、9E18.3、3J24.2、6E12.3、1P10.2、4L7.3、7H4.6、9O12.2、7H14.1和9E18.2的各种鼠单克隆抗GPVI抗体以及命名为A9、A10、C9、A4、C10、B4、C3和D11的几种人源噬菌体抗体scFv片段。发现这些抗体和scFv片段中的一些抑制GPVI与胶原蛋白的结合，包括抗体8M14.3、3F8.1、9E18.3、3J24.2、6E12.3、1P10.2、4L7.3、7H4.6和9O12.2以及scFv片段A10、A4、C10、B4、C3和D11。此外，发现9O12.2Fab片段完全阻断胶原蛋白诱导的血小板聚集和分泌，阻断纤维蛋白诱导的血小板聚集，抑制胶原蛋白刺激的或纤维蛋白刺激的血小板的促凝血活性以及在静态条件下血小板与胶原蛋白或纤维蛋白的粘附，在动脉血流条件下损害血小板粘附和防止血栓形成。WO2008/049928描述了衍生自9O12.2的scFv片段，其由(Gly4Ser)3肽连接的9O12.2单克隆抗体的VH和VL结构域构成。然而，目前已知的抗GPVI抗体均没有显示在体内有效用于预防和/或治疗心血管疾病。具体而言，已报道的大多数抗GPVI抗体似乎不适合用于开发人类医学用途的抗血栓剂，尤其是由于其动物来源。具体而言，已报道一些针对人GPVI的人源噬菌体抗体scFvs是抑制性的，但其亲和力似乎较低。此外，血小板表面上GPVI被二价或多价配体(如9O12.2全IgG)交联导致血小板经由GPVI二聚化以及经由GPVI与低亲和力Fc受体(FcγRIIA)交联而活化。相比之下，单价的9O12.2Fab和scFv片段是抑制性的。然而，这些片段不能用于治疗，因为它们的大小和它们的动物来源使得它们在人类患者中具有免疫原性。而且，scFv片段呈现短的半衰期，这限制了它们的治疗潜力。因此仍然需要在人体中无免疫原性的中和性GPVI拮抗剂。US2006/0088531描述了人scFv片段10B12，其与人GPVI结合的KD为约7.9.10-7M。Smethurstetal.，2004进一步描述了在人GPVI的Ig样C2型结构域1(D1)上被10B12结合的表位。这一表位包含人GPVI的残基R58、K61、R66、K79和R80(基于UniProtKB登录号Q9HCN6编号)。O’Connoretal.，2006还描述了对GPVI具有低亲和力(5.410-7M)的人scFv片段1C3，其既不阻断胶原蛋白诱导的血小板聚集，也不阻断GPVI与胶原蛋白的结合，但其增强了10B12抗体的抑制作用。GPVI中的1C3表位包含氨基酸I168，并且进一步推测这一表位可能包括残基S164和S182之间的区域，该区域是从小鼠到人类均高度保守的区域。因此，需要与现有技术的拮抗剂相比具有改善的亲和力、功效和半衰期的人源化抗体(即，在人体内无免疫原性的抗体)，作为有效且充分预防和/或治疗人心血管疾病的手段。而且，这些拮抗剂应当优选是易于纯化的。在本领域中，描述了诱导GPVI耗竭表型的抗GPVI抗体(WO2006/118350、WO2011/073954、EP2363416)。具体而言，WO2006/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其中所述蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含：‑来自hGPVI(SEQ ID NO：13)的氨基酸残基114至142的至少一个氨基酸残基，或来自相对于hGPVI(SEQ ID NO：13)的氨基酸残基114至142具有至少60％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和‑来自hGPVI(SEQ ID NO：13)的氨基酸残基165至187的至少一个氨基酸残基，或来自相对于hGPVI(SEQ ID NO：13)的氨基酸残基165至187具有至少60％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.05 EP 15179908.71.一种与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其中所述蛋白质与构象表位结合，所述构象表位包含：-来自hGPVI(SEQIDNO：13)的氨基酸残基114至142的至少一个氨基酸残基，或来自相对于hGPVI(SEQIDNO：13)的氨基酸残基114至142具有至少60％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和-来自hGPVI(SEQIDNO：13)的氨基酸残基165至187的至少一个氨基酸残基，或来自相对于hGPVI(SEQIDNO：13)的氨基酸残基165至187具有至少60％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其中所述构象表位包含来自hGPVI(SEQIDNO：13)的氨基酸残基121至135的至少一个氨基酸残基，或来自相对于hGPVI(SEQIDNO：13)的氨基酸残基121至135具有至少60％同一性的序列的至少一个氨基酸残基；和来自hGPVI(SEQIDNO：13)的氨基酸残基169至183的至少一个氨基酸残基，或来自相对于hGPVI(SEQIDNO：13)的氨基酸残基169至183具有至少60％同一性的序列的至少一个氨基酸残基。3.一种与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其中所述蛋白质与hGPVI结合的KD小于15nM，其中所述KD通过表面等离子体共振法使用960至1071RU的可溶性人GPVI以及使用PBSpH7.4作为运行缓冲液来测量，并且其中所述分离的人源化蛋白质在体内不诱导GPVI耗竭表型。4.根据权利要求1至3中任一项所述的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其是选自由全抗体、人源化抗体、单链抗体、Fv、Fab组成的组的抗体分子；或选自由单抗体、结构域抗体和纳米抗体组成的组的抗体片段；或选自由亲和体、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、anticalin、avimer、fynomer和versabody组成的组的单体抗体模拟物。5.根据权利要求1至4中任一项所述的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其是单价抗体。6.根据权利要求1至5中任一项所述的与人糖蛋白VI(hGPVI)结合的分离的人源化蛋白质，其中重链的可变区包含以下CDR中的至少一个：VH-CDR1：GYTFTSYNMH(SEQIDNO：1)；VH-CDR2：GIYPGNGDTSYNQKFQG(SEQIDNO：2)；和VH-CDR3：GTVVGDWYFDV(SEQIDNO：3)，或具有与SEQIDNO：1-3具有至少60％同一性的氨基酸序列的任何CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·比亚阿多，M·扬德特佩吕，
申请(专利权)人：艾科迪科尔生物技术公司，巴黎狄德罗大学巴黎第七大学，巴黎第十三大学，国家健康与医学研究院，巴黎第十一大学，
类型：发明
国别省市：法国,FR