阻断组蛋白识别结构域的小分子制造技术

本发明专利技术涉及干扰被组蛋白H4尾所占据的TONSL ARD构象空间的小分子。借助直接竞争或借助变构破坏结合口袋，这些小分子通过阻止或破坏H4尾K12‑R23和TONSL ARD的结合，从而靶向包含H4残基K12‑R23的TONSL结合口袋并且发挥作用。本发明专利技术人鉴定并解析了称为ARD(锚蛋白重复结构域)的TONSL组蛋白识别结构域的结构。

A small molecule that blocks the histones that recognize the domain

The present invention relates to small molecules that interfere with the conformational space of TONSL ARD occupied by the tail of histone H4. With the aid of direct competition or with the aid of allosteric destruction, these small molecules can inhibit or destroy the combination of the H4 tail K12 R23 and TONSL ARD by preventing or destroying the TONSL binding pockets of the H4 residue K12 R23, and play a role. The inventor identified and analyzed the structure of TONSL histone recognition domain, known as ARD (Anchorage repeat domain).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】阻断组蛋白识别结构域的小分子
本专利技术涉及TONSL蛋白的新型抑制剂，而TONSL蛋白是基因组稳定性所需的。在双链断裂(DSB)的DNA修复中以及在稳定正在复制的DNA中间体当中，通过无错同源重组(HR)，TONSL和MMS22L一起作为专职的异源二聚体而发挥作用。本专利技术人已经解析了TONSLARD在与其组蛋白底物(组蛋白H4尾)形成的复合物中的结构，为小分子、肽或多肽基于结构的合理药物设计提供了基础，所述小分子、肽或多肽能够通过直接竞争或通过变构破坏结合口袋，来阻止或破坏H4尾与TONSLARD的结合。
技术介绍
细胞持续暴露于不同来源的DNA损伤，并面对这种挑战，它们设计了一系列DNA修复策略。DNA双链断裂、复制叉受损的关键修复途径之一以及增殖细胞存活的关键在于同源重组(HR)。许多癌细胞经历高负荷的复制压力，使其容易发生HR抑制。癌细胞通常也依赖于该途径来修复常规化学疗法产生的DNA损伤；因此，由于受感染细胞的合成致死性，HR靶向药物在临床上具有吸引力。HR抑制剂的开发也具有重要的临床意义，因为PARP抑制剂杀死HR缺陷细胞。因此，阻断两种替代途径将产生比单独靶向任一途径更大的影响。此外，一些肿瘤细胞在其它DNA修复途径中有缺陷，因此依赖于HR，这使得它们对HR修复的抑制敏感。TONSL(Tonsoku样，NFKBIL2)是一种至关重要的HR调节因子，与MMS22L一起以异源二聚体复合物的形式发挥作用，通过HR来促进DSB和受损复制叉的修复。在HR中，提出认为TONSL-MMS22L用于调节Rad51到ssDNA上的加载。MMS22L或TONSL的耗竭导致细胞增殖显著减弱和显著的对拓扑异构酶I毒素喜树碱(CPT)的超敏反应，这最可能是由于不能促进RAD51介导的破损复制叉的修复而引起的。然而，调节DNA修复中TONSL-MMS22L功能的分子机制尚不清楚。TONSL-MMS22L与组蛋白H3-H4、组蛋白分子伴侣ASF1和依赖于TONSL锚蛋白重复结构域(ARD)的MCM2、4、6、7形成复合物，表明ARD可能对TONSL功能是重要的。ARD是一种常见的蛋白-蛋白相互作用基序，其由大约33个氨基酸的串联重复模块组成，存在于大量功能多样的蛋白中，包括转录起始因子、细胞周期调节因子、细胞骨架蛋白、离子转运蛋白和信号转导因子。解析了几种ARD蛋白的晶体结构，包括特异性结合在赖氨酸9的位置甲基化的组蛋白H3的G9a/GLPARD(Collins等人，NatStructMolCellBiol15：245，2008)。然而，大多数ARD的特异性仍然未知。序列相似性方面，TONSLARD与BARD1ARD高度相似。BARD1是一种特征明确的HR因子，是BRCA1的专属伴侣，是BRCA1的大多数细胞和肿瘤抑制因子功能所必需的(Westermark等人，MolCellBiol23：7926，2003)。可获得BARD1ARD的晶体结构(Fox等人，JBiolChem283：21179，2008)，但BARD1ARD的结合特异性是未知的，因此，无法为抑制剂的设计提供基础。因此，需要鉴定TONSLARD结合的靶分子，并获得这些蛋白复合物的晶体，以便以原子级别的分辨率解析它们的结构。这为确定该结合对于TONSL-MMS22L功能是否重要提供了基础，因此使其成为有吸引力的药物靶标。此外，结合口袋及其底物的高分辨率的结构可使技术人员(skilledaddressee)能够设计干扰TONSLARD与其靶分子结合的小分子，并随后以快速且可重现的方式验证生物测定中的效果。
技术实现思路
本专利技术人已经发现了将TONSL及其伴侣MMS22L募集至复制后染色质的分子机制，其打开了癌症治疗中靶向HR修复途径的道路。该机制依赖于通过TONSL锚蛋白重复结构域(ARD)结构域对K20位置上未修饰的组蛋白H4(H4K20me0)的识别，该结构域作为新型组蛋白识别结构域起作用。这项发现工作的亮点包括：1.结构和生物化学数据，其将TONSLARD鉴定为第一个组蛋白识别因子(reader)，其特异于K20上未甲基化的H4尾(H4K20me0)。H4K20me0特异于在DNA复制期间掺入的新合成组蛋白，对复制后染色质进行标记，直至K20me1得以建立的晚期G2/M。2.功能和结构数据，其显示通过ARD识别H4K20me0，TONSL结合与MCM2和ASF1形成的复合物中的可溶性新组蛋白，证明了将TONSL-MMS22L递送至复制染色质的方式。3.通过ARD识别H4K20me0，在复制后染色质中TONSL结合核小体组蛋白的功能性数据，并且证明这是在损伤的复制叉和DNA损伤处积累TONSL-MMS22L所需的。4.用TONLSARD突变体蛋白滴定MMS22L使其脱离染色质并对细胞有毒性的功能数据。5.TONSLARD突变体蛋白诱导G2/M停滞、复制相关的DNA损伤(53BP1灶)并降低存在和不存在喜树碱(CPT)时的活力。6.通过从染色质中去除TONSL，TONSL-MMS22L复合物在DNA修复中的功能被禁用。7.TONSL抑制剂，例如能够与TONSLARD结合的TONSL抑制剂。7.组蛋白H4肽或其功能同源物可以作为TONSL的抑制剂起作用。总之，这表明DNA复制留下了标记，其形式为在H4K20处未修饰的沉积的新组蛋白，其被TONSL-MMS22LHR修复复合物所识别，以区分复制前和复制后的染色质。此外，这项工作为理解如何通过关键HR因子TONSL来识别复制后染色质的状态提供了突破，其介导了在受损的复制叉和DSB之处加载Rad51。因此，靶向TONSLARD的小分子抑制剂能够使DSB和受损复制叉的有效HR修复得以失效。因此，本专利技术涉及干扰被组蛋白H4尾所占据的TONSLARD构象空间的小分子。这些小分子靶向TONSL的结合口袋，并通过直接竞争或通过结合口袋的变构破坏来阻止或破坏H4尾K12-R23与TONSLARD的结合，所述结合口袋包含H4残基K12-R23。因此，本专利技术一方面涉及，通过直接竞争或通过结合口袋的变构破坏而阻止或破坏BARD1ARD结合口袋中底物结合的小分子(通过与TONSLARD中H4尾K12-R23结合口袋的高度结构相似性进行定义)。专利技术的详细描述本专利技术人鉴定并解析了称为ARD(锚蛋白重复结构域)的TONSL组蛋白识别结构域的结构。重要的是，本专利技术人解析了与组蛋白底物(组蛋白H4尾)复合的TONSLARD的结构，为TONSL抑制剂的基于结构的合理药物设计提供了基础。鉴于DSB的HR和受损复制叉的修复中需要TONSL，TONSL抑制剂可有效地降低HR，并可单独使用或与常规化疗组合使用以杀死癌细胞。因此，本文所述的任何TONSL抑制剂可用于治疗癌症。本专利技术的复合物的晶体结构、重组TONSLARD、表达GFP-TONSL(野生型和组蛋白H4结合突变体)的细胞系，都有助于设计和鉴定干扰H4K20me0的TONSLARD识别的特异性小分子抑制剂。此后，本专利技术人还公开了用于TONSL抑制剂开发的生物化学和基于细胞测定的管线开发。这些数据和信息对于设计适合作为抗癌治疗剂的新型抑制剂是必不可少的。因此，本专利技术提供了用于计算机设计并随后进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种TONSL抑制剂，其中所述抑制剂抑制TONSL ARD和组蛋白H4的结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.02 DK PA201500605;2016.04.18 US 62/324,2571.一种TONSL抑制剂，其中所述抑制剂抑制TONSLARD和组蛋白H4的结合。2.根据权利要求2所述的TONSL抑制剂，其中所述抑制剂结合被组蛋白H4尾所占据的TONSLARD的构象空间，所述组蛋白H4尾包含残基K12-R23，其中所述抑制剂通过直接竞争或通过变构破坏结合口袋来阻止和/或破坏组蛋白H4和TONSLARD的结合。3.根据前述权利要求任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂结合TONSLARD的组蛋白H4尾结合表面。4.一种小分子，其靶向被组蛋白H4尾所占据的TONSLARD的构象空间，所述组蛋白H4尾包含残基K12-R23，并且所述小分子通过直接竞争或通过变构破坏结合口袋而发挥作用以阻止或破坏组蛋白H4尾K12-R23和TONSLARD的结合。5.根据权利要求4所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其通过分子间氢键、静电和/或范德华相互作用而靶向TONSLARD与跨越残基Lys12至Arg23的组蛋白H4尾之间的相互作用。6.根据权利要求4至5任一项所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其中所述分子靶向TONSLARD和组蛋白H4的Lys12-Gly13-Gly14-Ala15片段之间的分子间接触。7.根据权利要求4至6任一项所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其中所述分子靶向组蛋白H4的残基Gly13、Gly14和Ala15与TONSLARD的残基Asn507、Cys508、Trp641、Tyr645和Leu649之间的疏水相互作用。8.根据权利要求4至7任一项所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其中所述分子靶向H4Gly14的主链O和TONSLARDTrp641的Nε1之间、以及H4Ala15的主链N与TONSLARDTyr645的Oη之间的氢键。9.根据权利要求4至8任一项所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其中所述分子靶向组蛋白H4Lys16的主链O与TONSLARDAsn571的N82形成的氢键。10.根据权利要求4至9任一项所述的小分子或根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂，其能够阻断蛋白中的组蛋白识别结构域，所述蛋白选自TONSL、BARD1和ANKRD11。11.根据权利要求1至3和5至10任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂是肽或多肽，其任选地连接至缀合部分。12.根据权利要求11所述的抑制剂，其中所述抑制剂是包含序列Arg-His-Xaa-Lys的肽，其中所述Xaa是任何氨基酸。13.根据权利要求11所述的抑制剂，其中所述抑制剂是包含序列Arg-His-Xaa-Lys-Val-Leu的肽。14.根据权利要求11至13任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂是包含序列Val-Leu-Arg的肽。15.根据权利要求11至14任一项所述的抑制剂，其中所述抑制剂是包含序列Arg-His-Xaa-Lys-Val-Leu-Arg的肽。16.根据权利要求11至15任一项所述的抑制剂，其中所述肽或多肽包含或由以下组成：I.由SEQIDNO：23或SEQIDNO：34的氨基酸12至23组成的序列；或II.由SEQIDNO：23或SEQIDNO：34的氨基酸12至23的序列组成的功能同源物，其中至多5个氨基酸是取代的，并且其中所述肽至少包含SEQIDNO：34的Arg17、His18和Lys20；III.由SEQIDNO：23或SEQIDNO：34的氨基酸12至23的序列组成的功能同源物，其中至多6个氨基酸是取代的；条件是所述抑制剂不同于SEQIDNO：23所示的组蛋白H4。17.根据权利要求11至13任一项所述的抑制剂，其中所述肽或多肽包含或由以下组成：·由SEQIDNO：23或SEQIDNO：34的氨基酸9至25组成的序列；或·由SEQIDNO：23或SEQIDNO：34的氨基酸9至25的序列组成的功能同源物，其中至多5个氨基酸是取代的，并且其中所述肽至少包含SEQIDNO：34的Arg17、His18和Lys20；·由SEQIDNO：23或SEQIDNO：34的氨基酸9至25的序列组成的功能同源物，其中至多6个氨基酸是取代的；条件是所述抑制剂不同于SEQIDNO：23所示的组蛋白H4。18.根据权利要求11至14任一项所述的抑制剂，其中所述肽或多肽包含或由以下组成：·由SEQIDNO：23或SEQIDNO：34的氨基酸14至33组成的序列；或·由SEQIDNO：23或SEQIDNO：34的氨基酸14至33的序列组成的功能同源物，其中至多5个氨基酸是取代的，并且其中所述肽至少包含SEQIDNO：34的Arg17、His18和Lys20；·由SEQIDNO：23或SEQIDNO：34的氨基酸14至33的序列组成的功能同源物，其中至多6个氨基酸是取代的；条件是所述抑制剂不同于SEQIDNO：23所示的组蛋白H4。19.根据权利要求16至18任一项所述的抑制剂，其中在所述功能同源物中至多4个，优选至多3个，例如至多2个，例如至多一个氨基酸是取代的。20.根据权利要求11所述的抑制剂，其中所述抑制剂包含肽或由肽组成，所述肽选自SEQIDNO：29、SEQIDNO：30、SEQIDNO：31、SEQIDNO：32和SEQIDNO：33。21.根据权利要求11至20任一项所述的抑制剂，其中所述肽由至多40个氨基酸组成，例如至多25个氨基酸，例如至多20个氨基酸。22.根据权利要求11至16和21任一项所述的抑制剂，其中所述肽由至多15个氨基酸组成，例如至多12个氨基酸。23.根据权利要求11至22任一项所述的抑制剂，其中所述肽包含或由SEQIDNO：23的4至40个连续的氨基酸组成。24.根据权利要求11至23任一项所述的抑制剂，其中对应SEQIDNO：23的Lys20的氨基酸是未甲基化的。25.根据权利要求11所述的抑制剂，其中所述肽包含或由SEQIDNO：17、SEQIDNO：18、SEQIDNO：19、SEQIDNO：20、SEQIDNO：21或SEQIDNO：22组成。26.根据权利要求11所述的抑制剂，其中所述肽包含或由SEQIDNO：16的氨基酸512至692组成。27.根据权利要求11至26任一项所述的抑制剂，其中所述肽的C端是酰胺化的或烷基化的。28.根据权利要求11至27任一项所述的抑制剂，其中所述肽的N端是乙酰化的或甲酰基化的。29.根据权利要求11至28任一项所述的抑制剂，其中所述缀合部分是聚合物分子，例如聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。30.根据权利要求1至3任一项所述的抑制剂或根据权利要求4至10任一项所述的小分子，其中所述抑制剂或所述小分子是具有3-[(3-氨基环戊基)羰基]-1H-喹啉-4-酮核心的化合物。31.根据前述权利要求任一项所述的抑制剂，其中所述TONSLARD定义为SEQIDNO：16所示TONSL的氨基酸512至692。32.根据前述权利要求任一项所述的抑制剂，其中组蛋白H4是SEQIDNO：23所示组蛋白H4或者SEQIDNO：34所示组蛋白H4。33.根据权利要求2至32任一项所述的抑制剂，其中组蛋白H4尾的K12-R23对应着SEQIDNO：34的氨基酸12至23。34.根据权利要求4至10任一项所述的小分子或权利要求1至3和5至33任一项所述的抑制剂，其用作药物。35.根据权利要求4至10任一项所述的小分子或权利要求1至3和5至34任一项所述的抑制剂，其用于治疗癌症。36.权利要求4至10任一项所述的小分子或权利要求1至3和5至33任一项所述的抑制剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。37.以下之间的复合物的三维晶体：·多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·格罗斯，G·萨雷迪，黄洪达，C·哈蒙德，D·帕特尔，
申请(专利权)人：哥本哈根大学，纪念斯隆凯特琳癌症中心，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK