从未致敏T细胞群体产生HPV抗原特异性T细胞制造技术

本发明专利技术提供用于产生识别人乳头瘤病毒或HPV抗原的抗原特异性T细胞的安全、快速且有效的方法。

Generation of HPV antigen specific T cells from never sensitized T cell population

The invention provides a safe, fast and effective method for producing antigen specific T cells identifying human papillomavirus or HPV antigen.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从未致敏T细胞群体产生HPV抗原特异性T细胞相关申请的交叉引用本申请要求2015年10月30日提交的美国临时申请号62/248,818的优先权，所述临时申请以引用的方式并入。本申请涉及2016年3月21日提交的标题为“Generatingvirusorotherantigen-specificcellsforaTcellpopulation”的PCT/US2016/23413，其要求2015年3月20日提交的美国临时申请号62/135,851和62/135,888的优先权；并且涉及2014年10月28日提交的标题为“ExpansionofCMV-SpecificTcellsfromCMV-SeronegativeDonors”的PCT/US2014/62698，其要求2013年10月28日提交的美国临时申请号61/896,296的优先权。所有以上文件以引用的方式并入。关于联邦政府资助的研究或开发的声明这项研究部分由来自美国国立卫生研究院国家癌症研究所的基金资助，基金号：授予CatherineM.Bollard和ElizabethJ.Shpall的NCIPO1CA148600-02。专利技术背景专利
本专利技术涉及人乳头瘤病毒或HPV抗原特异性T细胞和用于从健康或未致敏供体的T细胞产生所述HPV抗原特异性T细胞的方法以及使用这些HPV特异性T细胞治疗由人乳头瘤病毒引起或与人乳头瘤病毒相关的疾病、病症或病状的基于细胞的疗法。现有技术描述一些目前基于T细胞的免疫疗法使用从含有T细胞和前体T细胞的样品扩增的病毒和肿瘤特异性T细胞。已显示病毒特异性T细胞在干细胞移植后针对病毒感染是有效的。使用病毒特异性T细胞群体的基于T细胞的细胞疗法可提供保护免受病毒感染的细胞并且与比抗病毒药物更少的副作用相关。1.使用扩增的病毒特异性群体的基于T细胞的疗法具有针对表达病毒的恶性肿瘤的活性2，3并且诱导清除循环白血病母细胞的移植物抗白血病作用。4由于记忆细胞群体的产生，这些免疫疗法具有提供终身保护的优点。3来自具有记忆T细胞的样本的细胞容易离体扩增，因为所述细胞所来源的供体先前曾遇到过这些病原体，且因此存在迅速离体扩增的现有记忆病毒特异性T细胞。5更重要的是，研究表明，单一HLA匹配足以介导这些T细胞的治疗功效，具有最小副作用。因此，可产生并维持第三方细胞库，以获得此类产品的现成使用。不幸的是，对于某些病毒感染和病毒相关肿瘤，并非所有这些细胞的潜在来源先前已经暴露于病原体。一个重要的例子是HPV，其在免疫受损的宿主中引起HPV感染6-8和HPV相关的恶性肿瘤，如宫颈癌。9-14在美国，9种HPV类型中的任一种的血清阳性率限于对于女性大约40％且对于男性大约20％。15大多数供体因此对HPV抗原未致敏。由于缺乏记忆T细胞，这对从这些样品中扩增HPV识别T细胞施加了障碍。从这些未致敏细胞群体(如来自未暴露的/血清反应阴性的健康供体的未致敏T细胞或来自脐带血的T细胞)中扩增抗原特异性T细胞是困难的，因为这些T细胞从未在体内被抗原引发。此类群体缺乏可容易扩增的抗原特异性记忆T细胞。在其他情况下，用于从未致敏供体扩增此类抗原特异性T细胞的所提出的方法目前使用病毒、病毒感染的细胞或病毒转化的细胞。16,17涉及使用病毒来产生用于治疗用途的抗原特异性T细胞的方法是不希望的，因为它们与临床风险增加和显著监管障碍相关。正是由于这个原因，呈肽形式的抗原已被用于扩增抗原特异性T细胞。18这些基于肽的方法朝向从未致敏供体产生HPV特异性T细胞的应用遇到了非常有限的成功。12产生对HPV具有特异性的T细胞的大多数成功尝试使用了来自先前已暴露于HPV抗原的患者的自体细胞。在一项这种研究中，虽然观察到超过1,200倍扩增，但这大部分限于8/156名宫颈癌患者和33/52名口咽癌患者以及仅1/20名健康供体，其中有反应的供体据信先前曾暴露于HPV抗原。12对于第三方库应用，不管先前暴露于HPV抗原，从健康供体生成HPV特异性T细胞是至关重要的。专利技术简述根据本专利技术的方法有利地允许HPV识别T细胞或HPV特异性T细胞的迅速和稳健扩增，提供识别靶向机会性HPV感染和HPV相关的恶性肿瘤的治疗上重要的抗原的T细胞，并且不需要使用活病毒或病毒转化的细胞。在此，本专利技术人描述了一种以临床上适用的方式制造这些细胞以用作供体来源的和现成的产品的新方式。本专利技术人利用他们在离体产生来自未致敏细胞来源的T细胞应答方面的经验来制造HPV识别T细胞或HPV特异性T细胞。基于HPV的免疫学性质，本专利技术人修改了产生抗原呈递树突细胞的方法，修改了用于扩增T细胞的细胞因子的浓度，并且使用了人工APC来帮助扩增T细胞数量。在其一个实施方案中，本专利技术提供一种用于产生HPV抗原特异性T细胞(或HPV抗原识别T细胞)的稳健方法。所产生的HPV识别T细胞可识别HPV抗原的单个表位、单一HPV抗原的多个表位或可识别不同HPV抗原上的表位。所述方法使用脉冲到不同抗原呈递细胞如树突细胞、单核细胞、K562细胞、人工抗原呈递细胞、PHA母细胞、B-母细胞、类淋巴母细胞和CD3-28母细胞上的HPV抗原的重叠肽文库，不同的引发和扩增细胞因子(包括但不限于IL2、IL7、IL15)和不同的选择方法(CD45RO缺失等)。16，17也可使用其他人工或替代抗原呈递细胞。由本专利技术产生的抗原特异性T细胞可用于治疗移植后病毒感染和肿瘤复发。这些抗原特异性T细胞及其前体可有利地储备入库(banked)或储存用于稍后施用至需要针对特定病原体或肿瘤病状的T细胞免疫的受试者。本专利技术包括一种从健康供体的免疫系统特异性地产生HPV抗原特异性T细胞的方法，所述供体中的大多数将是HPV血清反应阴性的并且因此具有未感染病毒的T细胞群体。本专利技术是一种方法及其目的在于预防移植后以及在HPV可能有问题的其他免疫受损的环境和情况(如HPV相关的恶性肿瘤)下的病毒感染。本专利技术以之前从未从未致敏T细胞进行的临床上相关的方式从未致敏T细胞制备多HPV-抗原特异性T细胞。因为本专利技术本身是一种方法和用途，所以它可容易地应用于从未致敏群体产生针对其他机会性病毒(如但不限于HHV6和BK病毒)的抗原特异性应答。它可扩展至包括来自与恶性肿瘤相关的疾病(如但不限于EBV和HIV)的病毒特异性抗原。它可与其他细胞产物、淋巴细胞清除方案和表观遗传修饰药物组合。其他医疗用途包括在移植前促进植入并为免疫缺陷患者提供治疗。本专利技术使用脉冲到潜在不同的抗原呈递细胞(树突细胞、单核细胞、K562细胞、PHA母细胞、B-母细胞、类淋巴母细胞和CD3-28母细胞)上的不同重叠肽文库、不同的引发和扩增细胞因子(包括但不限于IL2、IL7、IL15)和不同的选择方法(CD45RO缺失等)来产生HPV特异性T细胞。也可使用其他人工或替代抗原呈递细胞。本专利技术人还描述了一种由未致敏T细胞制造的所述细胞的第三方库，以及为供体选择最佳匹配的方法。本专利技术的方法安全、简单、快速且可重复，并且可用于根据用于各种不同患者的优质生产规范(GMP)产生HPV识别T细胞或HPV特异性T细胞。附图描述图1.使用本文公开的方法从健康供体(n＝5)产生识别HPV的T细胞。与无关抗原(自身蛋白肌动蛋白)相比，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生HPV抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括：(a)将来自含有未致敏免疫细胞的任何细胞来源的单核细胞分成若干部分；(b)用PHA或另一种有丝分裂原和IL‑2刺激所述样品的第一部分以产生在后续刺激过程中起抗原呈递功能的ATC活化的T细胞(“ATC”)，并任选地用放射或另一种试剂处理所述ATC以抑制其过生长；(c)使T细胞和T细胞前体细胞与树突细胞和树突状前体细胞分离；(d)低温保存或以其他方式保存所述T细胞和T细胞前体细胞；(e)用产生树突细胞并使树突细胞成熟的细胞因子或其他试剂和至少一种HPV肽抗原或HPV抗原混合物使第二部分中的树突细胞和树突状前体细胞分化以产生呈递至少一种HPV肽抗原的抗原呈递树突细胞，并且任选地用辐射或足以抑制其过生长的另一种试剂处理所述抗原呈递树突细胞；(f)在IL‑7和IL‑15存在下用在(e)中产生的所述树突状抗原呈递细胞刺激来自(d)的所述低温保存或以其他方式保存的T细胞和T细胞前体细胞以产生识别所述至少一种HPV肽抗原的抗原特异性T细胞；(g)在所述至少一种HPV肽抗原存在下，任选地在K562细胞或其他辅助细胞存在下在IL‑2和/或IL‑15存在下用(b)的所述ATC刺激通过(f)产生的抗原特异性T细胞；任选地，重复(g)一次或多次；以及(h)回收识别至少一种肽抗原的抗原特异性T细胞。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.30 US 62/248,8181.一种用于产生HPV抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括：(a)将来自含有未致敏免疫细胞的任何细胞来源的单核细胞分成若干部分；(b)用PHA或另一种有丝分裂原和IL-2刺激所述样品的第一部分以产生在后续刺激过程中起抗原呈递功能的ATC活化的T细胞(“ATC”)，并任选地用放射或另一种试剂处理所述ATC以抑制其过生长；(c)使T细胞和T细胞前体细胞与树突细胞和树突状前体细胞分离；(d)低温保存或以其他方式保存所述T细胞和T细胞前体细胞；(e)用产生树突细胞并使树突细胞成熟的细胞因子或其他试剂和至少一种HPV肽抗原或HPV抗原混合物使第二部分中的树突细胞和树突状前体细胞分化以产生呈递至少一种HPV肽抗原的抗原呈递树突细胞，并且任选地用辐射或足以抑制其过生长的另一种试剂处理所述抗原呈递树突细胞；(f)在IL-7和IL-15存在下用在(e)中产生的所述树突状抗原呈递细胞刺激来自(d)的所述低温保存或以其他方式保存的T细胞和T细胞前体细胞以产生识别所述至少一种HPV肽抗原的抗原特异性T细胞；(g)在所述至少一种HPV肽抗原存在下，任选地在K562细胞或其他辅助细胞存在下在IL-2和/或IL-15存在下用(b)的所述ATC刺激通过(f)产生的抗原特异性T细胞；任选地，重复(g)一次或多次；以及(h)回收识别至少一种肽抗原的抗原特异性T细胞。2.如权利要求1所述的方法，其还包括在(a)之前分离含有未致敏T细胞的单核细胞。3.如权利要求1所述的方法，其中所述单核细胞从脐带血获得。4.如权利要求1所述的方法，其中所述单核细胞从对所述至少一种HPV肽抗原未致敏的造血干细胞获得。5.如权利要求1所述的方法，其中所述单核细胞从含有来自其免疫系统对所述至少一种HPV肽抗原未致敏的受试者的干细胞、前体T细胞或T细胞的样品获得。6.如权利要求1所述的方法，其中(b)包括用PHA和IL-2刺激所述样品的第一部分以产生活化的T细胞(“ATC”)。7.如权利要求1所述的方法，其包括在(b)中用PHA和IL-2刺激约1至200万个、优选5至1500万个、最优选约8至1200万个单核脐带血细胞。8.如权利要求1所述的方法，其中(b)包括产生T-母细胞、B-母细胞、类淋巴母细胞或CD3-CD28母细胞而不是PHA母细胞作为活化的T细胞。9.如权利要求1所述的方法，其中通过以下方式使T细胞和/或T细胞前体细胞与树突细胞和树突状前体细胞分离：在足以使所述第二部分中的细胞粘附至细胞培养板或装置的条件下经由塑料粘附培养所述第二部分，且然后从所述细胞培养板或装置中除去T细胞和T细胞前体细胞，并回收附着于固体培养基的所述树突细胞和树突状前体细胞。10.如权利要求1所述的方法，其中在(e)中，所述树突细胞和树突状前体细胞在树突细胞的分化和维持所需的细胞因子存在下生长，所述细胞因子包括但不限于IL-4和GM-CSF。11.如权利要求1所述的方法，其中在(e)中，使所述树突细胞和树突状前体细胞经历用树突细胞成熟细胞因子或试剂成熟，所述细胞因子或试剂选自由以下中的一种或多种组成的组：LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE-1、PGE-2和其他免疫佐剂以及IL-4和GM-CSF。12.如权利要求1所述的方法，其中在(f)中或之前，处理所述T细胞或T细胞前体细胞以扩增CD45RA阳性细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·M·鲍莱德，C·克鲁兹，P·J·汉莱，
申请(专利权)人：儿童国家医疗中心，
类型：发明
国别省市：美国,US