在体外人造淋巴结用于治疗和表位作图的T细胞的敏化和扩增制造技术

具有残留疾病的HER2+浸润性乳腺癌(IBC)患者在新辅助化疗后具有抗HER2 1型T辅助细胞(Th1)细胞免疫缺陷和复发性疾病的重大风险。已经显示抗HER2 CD4+T细胞应答沿着乳腺癌连续统计逐渐减少‑健康供体和良性疾病患者的健康应答，HER2+导管原位癌患者的下调应答以及HER2+IBC患者几乎无应答。本发明专利技术涉及一种用于T细胞培养扩增的微环境的创建方法。扩增的T细胞可用于各种治疗和研究目的。

In vitro artificial lymph nodes for sensitization and amplification of T cells for treatment and epitope mapping

Patients with HER2+ invasive breast cancer (IBC) with residual disease have a major risk of anti HER2 1 T - assisted cell (Th1) cell immune deficiency and recurrent disease after neoadjuvant chemotherapy. It has been shown that anti HER2 CD4+T cell responses gradually decrease the health response of healthy donors and patients with benign disease along the continuous statistics of breast cancer, the down regulated response of the HER2+ catheter in situ cancer patients and the almost non response of the HER2+IBC patients. The invention relates to a method for creating a microenvironment for T cell culture and amplification. The expanded T cells can be used for various therapeutic and research purposes.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在体外人造淋巴结用于治疗和表位作图的T细胞的敏化和扩增相关申请的交叉引用本申请要求2015年3月26日提交的美国临时专利申请No.62/138,684和2015年3月26日提交的美国临时专利申请No.62/138,969的优先权，其各自均以全文引用的方式并入本文中。
技术介绍
具有残留疾病的HER2+浸润性乳腺癌(IBC)患者在新辅助化疗后具有抗HER21型T辅助细胞(Th1)细胞免疫缺陷和复发性疾病的重大风险。已经显示抗HER2CD4+T细胞应答沿着乳腺癌连续统计逐渐减少-健康供体和良性疾病患者的健康应答，HER2+导管原位癌患者的下调应答以及HER2+IBC患者几乎无应答。乳腺癌发病的终身风险几乎是八分之一。erb-B2致癌基因(HER-2/neu)是在大量乳腺癌、卵巢癌、胃食管癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌和其他实体瘤中过表达的分子驱动剂。HER2过表达(“HER2pos”)一种是包括约20-25％的乳腺癌(Meric，F.，等，J.AmColl.Surg.194：488-501(2002))的几种肿瘤类型中的驱动分子，其与侵袭性临床病程、抗化疗和乳腺癌的整体不良预后有关。见Henson,E.S.,Clin.Can.Res.12:845-53(2006)(“Henson，等”)和Wang,G.S.,Mol.Med.Rep.6:779-82(2012)。在乳腺癌初期，HER2过表达与增强的侵袭性(Roses，RE等，CancerEpidemiol.Bioomarkers&Prev.18(5)：1386-9(2009))、肿瘤细胞迁移(Wolf-Yadlin，A.,等，MolecularSystemsBiology2:54(2006))和促血管生成因子(Wen，XF等，Oncogene25：6986-96(2006))的表达相关，表明了HER2在促进致瘤性环境中的关键作用。在导管原位癌(“DCIS”)患者的回顾性分析中，过表达HER2的DCIS损伤与侵袭性乳腺癌相关的可能性高于不具有HER2过表达的DCIS病变的六倍以上。尽管靶向HER2的分子靶向治疗(即，/曲妥单抗)与化疗相结合显著改善了HER2pos乳腺癌患者的生存率(Piccart-Gebhart.，MJ等，N.Eng.J.Med353：1659-72(2005))，但是相当比例的患者变得对这种疗法具有抗性(Pohlmann，PR等，Clin.Cn.Res.15：7479-91(2009)(“Pohlman等”))。需要确定治疗失败风险高的患者亚组的策略，以及提高HER2靶向治疗应答率的新方法。尽管靶向HER2的分子靶向疗法(即曲妥珠单抗)在乳腺癌这种类型中已经产生了巨大的积极的临床效果，但对于晚期疾病状态下对现有的HER2疗法几乎具有普遍的抗性，加上相当比例的接受靶向治疗的妇女的疾病复发，证明了需要靶向HER2的其他策略。旨在减轻肿瘤进展和预防激发时复发的激活免疫系统针对HER2的疫苗的承诺尚未完全实现，仍然需要额外的检测和治疗来诊断和治疗HER2乳腺癌。最近已经阐明了全身抗HER2CD4+Th1应答在HER2驱动的乳腺肿瘤发生中的作用。已经确定在HER2pos乳腺癌中，在致瘤性连续体上的抗HER2CD4+Th应答的进行性丧失似乎是HER2特异性和独立的调节性T细胞(Treg)。具体来说，抗HER2CD4+Th1应答与HER2表达和疾病进展存在负相关性。Th1反应性特征谱显示在HER2pos乳腺肿瘤发生中跨连续体(HD(健康供体)àBD(良性乳腺活检)àHER2neg-DCIS(原位导管癌)àHER2neg-IBC(侵袭性乳腺癌)HER2pos-DCISàHER2pos-IBC(侵袭性乳腺癌)的抗HER2Th1免疫力的显著逐步下降，见Datta，J.,等，Oncolmmunology2015(印刷中)和于2015年3月13日提交的美国序列号14/658,095(统称为“Datta等”)。HER2-脉冲型1型偏振树突状细胞(“DC1”)疫苗接种后HER2pos浸润性乳腺癌中的抗HER2Th1抑制作用差异恢复，但使用曲妥珠单抗和化学疗法(“T/C”)或其他标准疗法如手术切除或放射进行HER2靶向治疗后，抑制应答未恢复。同上。恢复的抗HER2Th1应答似乎耐久至少约六个月或更长。T淋巴细胞亚群(CD4+或CD8+)的扩增是获得足够的T细胞进行过继性治疗或识别基于肽的疫苗的靶抗原上的表位的必要步骤。T细胞的扩增原则上是一个简单的过程。然而，在实践中存在许多技术问题，包括扩增水平不足、活化诱导的细胞死亡(凋亡)过早或抗原特异性和/或功能丧失。部分问题在于无法在体外复制体内淋巴结发生的抗原特异性T细胞扩增的环境。这些是包含除T淋巴细胞以外的许多不同细胞类型的专门组织，包括抗原递呈树突状细胞和基质细胞如上皮细胞。这些细胞类型中的每一种通过提供对于T细胞生长和维持细胞功能而言重要的接触依赖性信号(表面受体)和可溶性信号(细胞因子)起着不同的作用(目前已定义并且尚未得到表征)。仍然需要新的治疗癌症的方法。因此，本领域需要具有用于治疗或预防乳腺癌和其它恶性肿瘤的额外的免疫治疗方法。本专利技术满足了这种需求。
技术实现思路
在一个实施例中，本专利技术提供了扩增T细胞的方法。在一个实施例中，该方法包括使T细胞与树突状细胞，至少两种细胞因子和T细胞生长因子中的一种或多种接触。在一个实施例中，T细胞与抗原接触，从而产生抗原特异性T细胞。在一个实施例中，树突状体是I型树突状细胞。在一个实施例中，所述至少两种细胞因子是白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-15(IL-15)。在一个实施例中，T细胞生长因子是白细胞介素-2(IL-2)。在一个实施例中，所述方法包括：a)在体外使T细胞与抗原结合的自体I型树突细胞DC接触，从而产生抗原特异性T细胞；b)使抗原特异性T细胞与IL-7和IL-5接触以产生刺激的抗原特异性T细胞；c)将刺激的抗原特异性T细胞与IL-2接触，从而产生维持抗原特异性和细胞功能的扩增的抗原特异性T细胞群。在一个实施例中，本专利技术提供了通过本专利技术的方法产生的T细胞。在一个实施例中，本专利技术提供了通过根据权利要求1-6所述的方法产生的展现抗肿瘤活性的培养的扩增抗原特异性T细胞群，其中所述细胞扩增至足以在哺乳动物中有效治疗的数量。在一个实施例中，本专利技术提供了通过本专利技术的方法产生的展现抗肿瘤活性的培养的扩增抗原特异性T细胞群，其中将细胞扩增至足以有效表位作图的数目。在一个实施例中，本专利技术提供了编码来自抗原特异性T细胞的T细胞受体(TCR)的分离的多核苷酸，其中所述抗原特异性T细胞是通过本专利技术的方法产生的。在一个实施例中，本专利技术提供了一种免疫治疗方法，包括向有需要的受试者施用T细胞，其中通过本专利技术的方法产生T细胞。在一个实施例中，本专利技术提供了一种扩增T细胞群的方法，所述T细胞群包括从已经接种抗原疫苗的受试者的血液样品获得的至少一种T细胞，其包括以下步骤：使T细胞与一种或更多的树突状细胞或其前体、至少两种细胞因子和一种T细胞生长因子接触。在一个实施例中，血液样品含有至少一种特异于疫苗抗原的T细胞群和至少一种树突状细胞前体。在一个实施例中，将树突状细胞前体用抗原脉冲并激活本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.扩增T细胞的方法，所述方法包括使所述T细胞与树突状细胞，至少两种细胞因子和T细胞生长因子中的一种或多种接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.26 US 62/138,684;2015.03.26 US 62/138,9691.扩增T细胞的方法，所述方法包括使所述T细胞与树突状细胞，至少两种细胞因子和T细胞生长因子中的一种或多种接触。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞与抗原接触，从而产生抗原特异性T细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述树突状细胞是I型树突状细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两种细胞因子是白细胞介素-7(IL-7)和白细胞介素-15(IL-15)。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞生长因子是白细胞介素-2(IL-2)。6.根据权利要求1所述的方法，包括：a)将T细胞与体外结合抗原的自体I型树突状细胞DC接触，从而产生抗原特异性T细胞；b)使抗原特异性T细胞与IL-7和IL-5接触以产生刺激的抗原特异性T细胞；c)将刺激的抗原特异性T细胞与IL-2接触，从而产生维持抗原特异性和细胞功能的扩增的抗原特异性T细胞群。7.一种通过根据权利要求1-6所述的任何一种方法产生的T细胞。8.一种培养的扩增抗原特异性T细胞的群，其通过根据权利要求1-6所述的任何一种方法产生抗肿瘤活性，其中所述细胞扩增至足以在哺乳动物中有效治疗的数量。9.一种培养的扩增抗原特异性T细胞群，其通过根据权利要求1-6所述的任何一种方法产生抗肿瘤活性，其中将细胞扩增至足以有效表位作图的数目。10.编码来自抗原特异性T细胞的T细胞受体(TCR)的分离的多核苷酸，其中所述抗原特异性T细胞是通过根据权利要求1-6所述的任何一种方法产生的。11.一种免疫治疗方法，包括将T细胞施用于有需要的受试者，其中所述T细胞通过根据权利要求1-6所述的任何一种方法产生。12.一种扩增T细胞群的方法，所述T细胞群包含从已经接种抗原的受试者的血液样品获得的至少一种T细胞，包括以下步骤：使所述T细胞与一种或多种树突细胞或其前体、至少两种细胞因子和一种T细胞生长因子接触。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述血液样品含有至少一种特异于疫苗抗原的T细胞群和至少一种树突状细胞前体。14.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：布莱恩·J·赫尔尼奇，莉亚·洛温菲尔德，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学理事会，
类型：发明
国别省市：美国,US