一种方法技术

本公开教导了用于在植物中产生环状肽的方法。术语“环状肽”包括但不限于环肽。环状肽可以是天然地环状的，或者可以是在植物中导致呈环状的天然线性肽。在一个实施方案中，从植物提取环状肽以用于多种应用，包括药理学应用，诸如癌症、心血管疾病、传染病、免疫疾病和疼痛的治疗。在另一个实施方案中，环状肽保护植物或植物部分免受病原体感染或侵染。

A method

This disclosure teaches a method for producing cyclic peptides in plants. The term \cyclic peptide\ includes but not limited to cyclic peptides. Cyclic peptides can be naturally ring-shaped or may be a natural linear peptide in plants. In an implementation scheme, cyclic peptides are extracted from plants for use in a variety of applications, including pharmacological applications such as cancer, cardiovascular disease, infectious diseases, immune diseases and pain treatment. In another embodiment, cyclic peptides protect plants or plants from infection or infection by pathogens.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种方法申请数据本申请与2015年9月30日提交的标题为“Amethod”的澳大利亚临时专利申请No.2015903984和2015年10月5日提交的标题为“Amethod”的澳大利亚临时专利申请No.2015904036相关并要求其优先权，所述临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。本说明书涉及序列表。“ST25.txt”文件是ANSI格式。该文件通过引用整体并入本说明书。背景领域本公开总体上涉及在植物中生产环状肽。相关领域的描述本说明书中由作者引用的出版物的著录项目内容按字母顺序收集在说明书结尾处。本说明书中对任何现有技术的引用不是且不应被视为承认或以任何方式暗示该现有技术构成任何国家的公知常识的一部分。蛋白酶在整个自然界中是丰富的，并且对于广泛的细胞过程是必不可少的。它们通常用于水解多肽链，导致靶序列降解或成熟为生物活性形式。不太常见的是，蛋白酶可以充当连接酶来连接不同的多肽，产生新的或以变通方式剪接的变体。已报道了用于诸如以下的过程的这种不常见的功能：外源凝集素伴刀豆球蛋白A的成熟(Sheldon等(1996)Biochem.J.320:865–870)、通过主要组织相容性复合物I类分子的肽呈递(Hanada等(2004)Nature427:252-256)以及细菌蛋白至细胞壁的锚定(Mazmanian等(1999)Science(80)285:760–763)。这种酶促转肽作用还涉及核糖体合成的环状肽的骨架环化(Barber等(2013)J.Biol.Chem.288:12500–12510；Nguyen等.(2014)Nat.Chem.Biol.10:732–738；Luo等(2014)Chem.Biol.21:1610-1617；Lee等(2009)J.Am.Chem.Soc.131:2122–2124)。基因编码的环状肽已经在包括植物、真菌、细菌和动物的一系列生物体中被鉴定(Arnison等(2013)NatProdRep30:108–160)。在植物中，它们被分成四类：环肽类(例如原型环肽kalataB1[kB1])[Gillon等(2008)PlantJ.53:505–515；Saska等(2007)J.Biol.Chem.282:29721–29728]；PawS衍生的胰蛋白酶抑制剂(例如，向日葵胰蛋白酶抑制剂(SFTI))[Mylne等(2011)Nat.Chem.Biol.7:257–9]；knottin胰蛋白酶抑制剂(例如，木鳖子胰蛋白酶抑制剂(MCoTI-II))[Mylne等(2012)PlantCell24:2765–78]；和orbitides(例如segetalins)[Barber等(2013)同上]。其中，虽然环肽是研究得最深入的，但它们在植物中的重组生产迄今已经面临重大的技术挑战。环肽最早在非洲植物白花蛇舌草(Oldenlandiaaffinis)中被鉴定出来，其显示针对农业相关害虫的杀虫、杀线虫和杀钉螺活性(Jennings等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:10614–10619；Plan等(2008)J.Agric.FoodChem.56:5237–5241；Colgrave等(2008)Biochemistry47:5581–5589；Colgrave等(2009)ActaTrop.109:163–6)。其它报道的功能包括神经降压肽拮抗作用(Witherup等(1994)J.Nat.Prod57:1619–1625)、抗HIV活性(Gustafson等(2000)J.Nat.Prod63:176–178)、抗微生物活性(Tam等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:8913–8918)、细胞毒性活性(Lindholm等(2002)Mol.CancerTher.1:365–369)、子宫收缩活性(Gran(1973)Actapharmacol.toxicol.33:400–408)以及溶血(Tam等(1999)同上)和防污性质(Goransson等(2004)J.Nat.Prod.67:1287–1290)。环肽的特征在于胱氨酸结基序，其与主链环化一起赋予优异的稳定性。这已在环肽框架作为药物支架方面备受关注；通过将生物活性序列成功嫁接到和胰蛋白酶抑制剂环肽中(Poth等(2013)Biopolymers100:480–91)提高了这一潜力。主链环化还可增加生物活性线性肽的稳定性和口服活性，表明这种修饰将获得广泛的应用(Clark等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.UnitedStatesAm.102:13767-13772；Clark等(2010)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.49:6545–8；Chan等(2013)Chembiochem14:617–24)。然而，在非天然环肽生产者的转基因植物中环肽的表达很差，阻碍了农业相关生物活性向其它植物的转移(Gillon等(2008)同上；Conlan等(2012)J.Biol.Chem.287:28037–46)。因此，阐明环肽生物合成固有的酶促环化机制不仅对于实现环肽的药物和农业潜力、而且对于提高不相关的生物活性肽的环化效率都是重要的。环肽由前体分子产生，在所述前体分子中环肽序列通常侧接N-末端和C-末端前肽。第一加工事件是除去N-末端前肽，产生与C-末端前结构域保持连接的线性前体(Gillon等(2008)同上)。最终的成熟步骤涉及该C末端区域的酶促切割以及随后的游离C端和N端的连接。然而，迄今为止仅鉴定了四种天然环化酶(Barber等(2013)同上；Nguyen等(2014)同上；Luo等(2014)同上；Lee等(2009)同上；Gillon等(2008)同上)。这些酶中获得最确切表征的是丝氨酸蛋白酶PatG，其负责细菌蓝细菌素的成熟(Lee等(2009)同上)。在植物中，据报道丝氨酸蛋白酶PCY1促进segetalins(来自石竹科的环状肽)的环化(Barber等(2013)同上)。在其它三类植物来源的环状肽中，C-末端切割位点的P1残基处的强Asx序列保守性表明称为液泡加工酶(VPE)或天冬酰胺酰内肽酶(AEP)的一组半胱氨酸蛋白酶参与该过程(Gillon等(2008)同上)。从产生环肽的植物蝶豆中分离出称为蝶豆粘酶-1(butelase-1)的AEP，其显示环化来自白花蛇舌草的kB1的经修饰的前体，证实了该组酶体外介导环化的能力(Nguyen等(2014)同上)，条件是在待环化的多肽前体的末端添加适当的识别序列。已经重组地生产了仅一种具有任何环化能力的AEP，该AEP是非常低效的，主要产生水解底物(Bernath-Levin等(2015)Chemistry&Biology22:1-12)。还没有AEP被有效地用于在植物中生产环状肽。存在开发在植物中高效产生环状肽的方法的需要。概述本公开教导了用于在植物中产生环状肽的方法。术语“环状肽”包括但不限于环肽。环状肽可以是天然地环状的，或者可以是在植物中呈环状的天然线性肽。在一个实施方案中，从植物提取环状肽以用于多种应用，包括药理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在植物或植物种子或者其后代或后代种子中产生环状肽的方法，所述方法包括在足以产生环状肽的条件下共表达重组核酸一段时间，所述重组核酸编码具有肽环化活性的天冬酰胺酰内肽酶(AEP)液泡加工酶和编码环状肽的线性多肽前体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.30 AU 2015903984;2015.10.05 AU 20159040361.一种用于在植物或植物种子或者其后代或后代种子中产生环状肽的方法，所述方法包括在足以产生环状肽的条件下共表达重组核酸一段时间，所述重组核酸编码具有肽环化活性的天冬酰胺酰内肽酶(AEP)液泡加工酶和编码环状肽的线性多肽前体。2.权利要求1的方法，其中将编码所述多肽前体的重组核酸引入包含稳定地引入的编码所述AEP的重组核酸的植物细胞中。3.权利要求1的方法，其中将编码所述AEP的重组核酸引入包含稳定地引入的编码所述前体多肽的重组核酸的植物细胞中。4.权利要求1的方法，其中编码AEP和多肽前体中的每一种的重组核酸在两个分别的核酸构建体中表达。5.权利要求1的方法，其中编码所述AEP和多肽前体中的每一种的重组核酸在单个核酸构建体中表达。6.权利要求4的方法，其中所述单个构建体是由包含区段的多核苷酸组成的多基因表达载体(MGEV)，每个区段编码功能性蛋白质，每个区段通过编码接头肽的接头区段以线性序列连接至下一个区段，所述区段全部位于可操作地连接至单个启动子的同一阅读框架中，其中至少一个区段编码所述AEP并且至少一个另外的区段编码所述多肽前体。7.权利要求4或7的方法，其中所述核酸构建体是病毒表达载体。8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述重组核酸的表达受组织特异性启动子调节。9.权利要求8的方法，其中所述组织特异性启动子对于选自叶、茎、花、种子和根的组织是特异的。10.权利要求9的方法，其中所述组织特异性启动子是叶特异性启动子。11.权利要求9的方法，其中所述组织特异性启动子是种子特异性启动子。12.权利要求9的方法，其中所述组织特异性启动子是根特异性启动子。13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述AEP来源于耳草属(Oldenlandia)并且包含在最佳比对后与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和/或SEQIDNO:8具有至少80％相似性的氨基酸序列，所述氨基酸序列保留AEP和环化活性。14.权利要求13的方法，其中所述AEP选自SEQIDNO:2、4、6和8。15.权利要求1的方法，其中从所述植物或植物种子中提取所述环状肽。16.权利要求1的方法，其中所述环状肽呈现植物提取物或植物材料的分离碎片的形式。17.权利要求15或16的方法，其中所述环状肽表现出抗病原性、治疗性或疼痛缓解性活性。18.权利要求17的方法，其中所述治疗性活性包括癌症、肥胖症、心血管疾病、传染病和免疫疾病的治疗。19.权利要求15或16或17或18的方法，其中所述环状肽包含融合或嵌入在环肽主链框架中的功能性部分。20.权利要求1的方法，其中产生所述环状肽以保护植物免受病原体感染或侵染。21.权利要求20的方法，其中所述病原体是真菌、细菌、线虫、蠕虫、血吸虫、病毒或原生动物生物体。22.权利要求1的方法，其中所述植物选自本塞姆氏烟草(N.benthamiana)、烟草、卡罗拉、马铃薯、布什豆、玉米、大豆、小麦、苜蓿、大麦、蓖麻子、三叶草、棉花、亚麻、燕麦、油菜、水稻、黑麦、黑麦草、红花、高粱、甜菜、向日葵、番茄、莴苣、芹菜、西兰花、花椰菜、葫芦、洋葱、观赏性开花植物或拟南芥(Arabidopsis)。23.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·珀恩，K·S·哈里斯，M·A·安德森，D·科莱克，
申请(专利权)人：赫希玛有限公司，昆士兰大学，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU