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检测人Legumain的ELISA检测试剂盒及其应用制造技术

技术编号:18457767 阅读:69 留言:0更新日期:2018-07-18 12:18
本发明专利技术公开了检测人Legumain的ELISA检测试剂盒及其应用。本发明专利技术所提供的检测人Legumain的ELISA检测试剂盒,包括包被捕获抗体的酶标板、封闭液、洗涤液、生物素标记的检测抗体、酶标生物素、底物显色液、终止液;所述捕获抗体是由名称为LGMN‑1,保藏号为CGMCC NO.12994的杂交瘤细胞株分泌产生;所述检测抗体是由名称为LGMN‑2,保藏号为CGMCC NO.12995的杂交瘤细胞株分泌产生。本发明专利技术填补了人Legumain定量检测的空白,它以双抗体酶联免疫反应为测定基点,具有灵敏度高,特异性好,重复性高和检测准确快速的优点。

ELISA detection kit for detecting human Legumain and its application

The invention discloses a ELISA detection kit for detecting human Legumain and its application. The present invention provides a ELISA detection kit for detecting human Legumain, including an enzyme labeled plate, a sealing solution, a washing liquid, a biotin labeled detection antibody, an enzyme biotin, a substrate chromogenic solution, a terminating solution, which is a hybridoma cell named LGMN 1 and a CGMCC NO.12994 of CGMCC NO.12994. The detected antibody is secreted by hybridoma cell line named LGMN 2 and the storage number is CGMCC NO.12995. The invention has filled the blank of quantitative detection of human Legumain, and it has the advantages of high sensitivity, good specificity, high repeatability and accurate detection with double antibody enzyme linked immunosorbent reaction as the base point.

【技术实现步骤摘要】
检测人Legumain的ELISA检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物医药工程
,尤其涉及检测人Legumain的ELISA检测试剂盒及其应用。
技术介绍
乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌。中国不是乳腺癌的高发国家,但是今年我国乳腺癌的发病率的增长速度却高出高发国家1~2个百分点。乳腺癌已经成为当前社会的重大公共卫生问题,早发现,早治疗可以极大地提高乳腺癌的存活率。Legumain(C13)(EC3.4.22.34)又称天冬酰胺内肽酶(asparaginylendopep-tidase,AEP),是一种溶酶半胱氨酸蛋白酶,是半胱氨酸蛋白酶C13家族一个新成员。人的Legumain基因定位于14号染色体,编码由433个氨基酸残基组成的多肽链,去糖基化后成为具有生物活性的成熟酶,与小鼠具有83%的同源性。人的legumain蛋白具有3种形式,分别为56kD的酶原前体,46kD和36kD成熟酶。Legumain的活性催化中心是由组氨酸(His)和半胱氨酸(Cys)组成的催化二联体,是Legumain发挥催化活性所必需的,也是每一个C13家族成员必有的结构。与正常组织相比,Legumain在小鼠和人类多种实体瘤组织中高表达,尤其是在肿瘤细胞、新生血管内皮细胞和肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-AssociatedMacrophages,TAMs)中,而在体外培养的相应肿瘤细胞株中却不表达。Liu等最先报道Legumain与肿瘤发生发展有关。他们通过Westernblot和免疫组化分析,发现在多种鼠肿瘤细胞中,Legumain表达增高,而在体外培养的各肿瘤细胞株中则不表达。Liu等还检测了人正常组织及多种实体瘤组织,结果显示在正常组织中,Legumain表达极低,而在多种实体瘤组织中(如乳腺、结肠、肺、前列腺、卵巢肿瘤和中枢神经系统恶性肿瘤)Legumain高表达。侵袭和转移是恶性肿瘤的播散方式,也是影响肿瘤患者的治疗效果和预后的重要因素。Legumain与整合素形成复合物,在实体肿瘤的低氧和酸性微环境中,具有激活肿瘤细胞Pro-MMP2和Pro-CathepsinL的功能,促进肿瘤生长、侵袭和转移。为了证实Legumain的表达是否与肿瘤的分化程度、坏死、凋亡及预后相关。Murthy等通过Westernblot和免疫组织化学方法,对164例原发性结肠癌、34例远端正常粘膜组织、89例癌旁组织及33例淋巴结转移癌组织样本进行临床病理检测,结果表明,在原发性结肠癌中,Legumain表达明显高于远端正常组织和癌旁组织(P<0.05),但与淋巴结转移癌组织样本无显著差异(P>0.05)。同时,Legumain在肿瘤患者瘤体(P=0.01)或基质中的表达(P=0.04)水平较低时,其预后较好。Gawenda等、通过免疫组织化学方法研究了432例乳腺浸润癌和128例乳腺非癌组织样本,证实人乳腺癌组织中Legumain高表达,并且与乳腺癌临床病理变化有一定的相关性。Lin(Linet.al.,JNCI,2014.)等报道了乳腺癌病人细胞内的Legumain在TRAF6的催化下进行泛素化,然后与HSP90α形成复合体被运输到细胞外随血液循环系统到达远端组织,在远端组织进行活化后促进肿瘤的迁移和扩散,并且已证实乳腺癌病人血清中Legumain的水平与癌症的发展阶段呈一定的相关性。血清中的Legumain水平可以促进肿瘤的侵袭和扩散,用抑制剂或者抗体阻断血清中的Legumain作用可以消除小鼠体内肿瘤的扩散。因此,Legumain作为一种新的生物学指标,目前临床上暂时没有针对其的检测方法,在监测肿瘤的发生发展中的应用还属空白。
技术实现思路
为了弥补以上领域的不足,本专利技术提供了一种检测人Legumain的ELISA检测试剂盒。本专利技术所提供的检测人Legumain的ELISA检测试剂盒,包括包被捕获抗体的酶标板、封闭液、洗涤液、生物素标记的检测抗体、酶标生物素、底物显色液、终止液;所述捕获抗体是由名称为LGMN-1,保藏号为CGMCCNO.12994的杂交瘤细胞株分泌产生;所述检测抗体是由名称为LGMN-2,保藏号为CGMCCNO.12995的杂交瘤细胞株分泌产生。所述试剂盒还包含人Legumain标准抗原液,用于定量检测人Legumain。所述包被捕获抗体的酶标板是由如下方法制备得到的:用包被缓冲液将捕获抗体LGMN-1稀释,然后加入到酶标板孔中,4℃反应过夜;甩掉包被缓冲液后,拍干,加入封闭液,反应,甩掉封闭液,拍干,即得所述包被捕获抗体的酶标板;所述包被缓冲液为pH值为9.0~9.6的0.1mol/L碳酸盐缓冲液。所述酶标生物素为辣根过氧化物酶标记的生物素。所述的封闭液是含质量百分比浓度为1~10%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)。所述洗涤液是含质量体积比为0.1%Tween-20的磷酸盐缓冲液。所述底物显色液是过氧化尿素和四甲基联苯胺。所述终止液是2M硫酸溶液。本专利技术还提供了定量检测人Legumain的ELISA检测试剂盒,包括包被捕获抗体的酶标板、人Legumain标准抗原液、封闭液、洗涤液、生物素标记的检测抗体、酶标生物素、底物显色液、终止液;所述捕获抗体是由名称为LGMN-1,保藏号为CGMCCNO.12994的杂交瘤细胞株分泌产生;所述检测抗体是由名称为LGMN-2,保藏号为CGMCCNO.12995的杂交瘤细胞株分泌产生。所述检测人Legumain的ELISA检测试剂盒在制备定性和/或定量检测人Legumain的产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的测定基础是人Legumain的双抗体夹心ELISA反应。酶标板包被有捕获人Legumain的抗体LGMN-A,当加入游离的人Legumain(标准品或样品血清),游离的人Legumain被捕获抗体捕获;之后加入生物素标记的人Legumain检测抗体LGMN-B,没有被结合的检测抗体在洗涤步骤中被除去;然后加入亲和素和酶标生物素,洗涤后将酶底物(过氧化尿素和四甲基联苯胺)加入到孔中并且孵育。结合的酶标生物素将无色的发光剂转化为蓝色产物。加入反应停止液2M硫酸后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值,样品中的人Legumain与吸光度值成正比,按照绘制的校正曲线定量计算。本专利技术填补了人Legumain定量检测的空白,它以双抗体酶联免疫反应为测定基点,具有灵敏度高,特异性好,重复性高和检测准确快速的优点。此方法检测费用低,检测样本数量大,可以用于临床定量检测肿瘤组织和淋巴组织中的人Legumain,根据检测水平来评估肿瘤扩散的风险,可在肿瘤发生的早前期对病人采取治疗措施,控制肿瘤的恶性发展,提高癌症的治愈率和病人的存活率。利用血清中的legumain水平来评估肿瘤的扩散风险在国际上尚属先例,将会有很好的发展前景。附图说明图1为重组质粒pCDNA3.1-tpa-LGMN的酶切鉴定结果图;其中1为tpa-hLGMNPCR片段,2为pcDNA3.1-tpa-hLGMN双酶切,M为DNA分子量标准M本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.检测人Legumain的ELISA检测试剂盒,其特征在于:包括包被捕获抗体的酶标板、封闭液、洗涤液、生物素标记的检测抗体、酶标生物素、底物显色液、终止液;所述捕获抗体是由名称为LGMN‑1,保藏号为CGMCC NO.12994的杂交瘤细胞株分泌产生;所述检测抗体是由名称为LGMN‑2,保藏号为CGMCC NO.12995的杂交瘤细胞株分泌产生。

【技术特征摘要】
1.检测人Legumain的ELISA检测试剂盒,其特征在于:包括包被捕获抗体的酶标板、封闭液、洗涤液、生物素标记的检测抗体、酶标生物素、底物显色液、终止液;所述捕获抗体是由名称为LGMN-1,保藏号为CGMCCNO.12994的杂交瘤细胞株分泌产生;所述检测抗体是由名称为LGMN-2,保藏号为CGMCCNO.12995的杂交瘤细胞株分泌产生。2.根据权利要求1所述的检测人Legumain的ELISA检测试剂盒,其特征在于:还包含人Legumain标准抗原液,用于定量检测人Legumain。3.根据权利要求1或2所述的检测人Legumain的ELISA检测试剂盒,其特征在于:所述包被捕获抗体的酶标板是由如下方法制备得到的:用包被缓冲液将捕获抗体LGMN-1稀释,然后加入到酶标板孔中,4℃反应过夜;甩掉包被缓冲液后,拍干,加入封闭液,反应,甩掉封闭液,拍干,即得所述包被捕获抗体的酶标板;所述包被缓冲液为pH值为9.0~9.6的0.1mol/L碳酸盐缓冲液。4.根据权利要求1或2所述的检测人Legumain的ELISA检测试剂盒,其特征在于:所述酶标生物素为辣根过氧化物酶标记的生物素。5.根据权利要求1或2所述的检测人Legu...

【专利技术属性】
技术研发人员:李伟
申请(专利权)人:李伟
类型:发明
国别省市:北京,11

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