本发明专利技术涉及血清CA2蛋白在制备肝癌诊断或预后评估试剂盒中的应用及试剂盒。本发明专利技术的有益效果主要体现在：1、CA2可作为一种新的肝癌诊断生物标记物。2、血液检测成本低，样本收集和处理简单，在任何必须情况下均可重复取样可以作为理想的疾病诊断和预后判断材料，CA2可以作为肝癌预后的标志物，并通过调控肝癌细胞的生物学功能影响肝癌的预后。
Application of serum CA2 protein in the preparation of diagnostic kit for liver cancer diagnosis and prognosis
The invention relates to the application and reagent kit of serum CA2 protein in the preparation of diagnostic kit for liver cancer diagnosis or prognosis. The beneficial effects of the invention are as follows: 1. CA2 can be used as a new biomarker for the diagnosis of liver cancer. 2. The blood test cost is low, the sample collection and treatment are simple. In any case, repeated sampling can be used as an ideal diagnosis and prognostic material for disease. CA2 can be used as a marker for the prognosis of liver cancer, and it can affect the prognosis of liver cancer by regulating the biological function of hepatoma cells.
【技术实现步骤摘要】
血清CA2蛋白在制备肝癌诊断或预后评估试剂盒中的应用(一)
本专利技术涉及血清CA2蛋白在制备肝癌诊断或预后评估试剂盒中的应用及试剂盒。(二)
技术介绍
肝癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，其恶性程度高、预后差、发病率呈逐年上升趋势。我国是肝癌高发区，据最新中国癌症统计显示，我国肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位，严重威胁人们的健康和生命。目前以手术切除为主的综合治疗，仍然是肝癌治疗的主要模式和最有效手段，然而肝癌术后极易转移复发，术后1年内的复发转移率高达20％-30％，5年内的复发转移率更是高达50％-70％。因此肝癌易转复发移的生物学特性是目前进一步提高肝癌治疗效果、降低肝癌死亡率、提高肝癌远期生存率的瓶颈问题。若能在HCC复发转移前，及早预测、诊断并及时采取积极有效的措施进行防治，对进一步提高肝癌的治疗效果，将具有重要意义。碳酸酐酶II(CarbonicAnhydraseII，CA2)是酸酐酶家族中活性最强的一员，参与机体气体运输、酸碱调节和组织的分泌等功能，在维持内环境的稳定方面发挥重要作用。由于CA2能高效催化CO2的水合反应，生成H+和HCO3-，HCO3-与细胞内Cl-交换来维持细胞内碱性环境，细胞内H+通过H+-Na+离子泵方式运输到细胞外，将细胞外变为酸性环境。因此，CA2有可能是通过可逆性催化CO2和HCO3-的相互转化，参与细胞外微环境的酸化。这表明CA2能通过调节肿瘤细胞微环境的pH影响肿瘤的发生；而胞外微环境的低pH则一般被认为是肿瘤富于侵袭性和预后差的一种标志，因此CA2表达水平的改变对肿瘤发生及其生物学行为有重要影响。(三)专利
技术实现思路
本专利技术目的是对CA2能否作为肝癌诊断和预后标志物进行研究，提供血清CA2蛋白在制备肝癌诊断或预后评估试剂盒中的应用及试剂盒。本专利技术采用的技术方案是：血清CA2(CarbonicAnhydraseII)蛋白在制备肝癌诊断或预后评估试剂盒中的应用。本专利技术还涉及一种肝癌诊断或预后评估试剂盒，所述试剂盒以血清CA2蛋白的特征肽段为检测标志物，主要包括：根据血清CA2蛋白的特征肽段合成的重标肽段(重标精氨酸或赖氨酸13C，15N)、检测试剂以及CA2蛋白的ELISA试剂盒。具体的，所述血清CA2蛋白的特征肽段序列为：GGPLDGTYR或SADFTNFDPR。所述检测试剂为本领域质谱检测中的常用试剂，包括PBS(pH7.4)、胰酶(测序级)、碳酸氢铵(500mM)、水(质谱级)、乙腈(色谱级)、甲酸。所述CA2蛋白的ELISA试剂盒可自行制备，也可采用市购商品。本专利技术利用iTRAQ(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)结合MS/MS技术检测肝癌病人癌组织、癌旁组织和远癌组织分泌蛋白和利用iTRAQ结合MS/MS技术检测肝癌病人术后复发前随访血清，共同发现生物标志物CA2。其在肝癌组织和癌旁组织中的分泌量明显高于远癌组织，且肝癌组织的分泌显著高于癌旁组织，并且CA2蛋白在肝癌病人复发前血清中浓度明显高于未复发病人的血清浓度，经ELISA和平行反应监测(Parallelreactionmonitoring，PRM)验证表明CA2蛋白在肝癌病人血清中浓度明显高于健康人，其在复发病人中血清浓度明显高于未复发病人。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术采用基于iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术，整合体外分泌蛋白质组学和体内血清蛋白质组学数据对肝癌病人进行全面系统的研究，提供了血清CA2蛋白作为肝癌病人血清诊断和预后标志物的新用途和试剂盒，该标志物经过ELISA和质谱PRM验证，结果更为可靠，可为临床应用提供有价值的信息。(四)附图说明图1为肝癌组织分泌蛋白质组工作流程图；图2为CA2蛋白的肽段GGPLDGTYR和SADFTNFDPR的PSM图谱；图3为CA2质谱PRM验证结果；图4为PRM检测肝癌病人和健康人血清中的CA2浓度；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；图5为CA2在肝癌诊断中灵敏度和特异性的ROC曲线评估；图6为ELISA检测复发/未复发肝癌病人血清CA2浓度；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；图7为CA2诊断肝癌术后复发的ROC曲线；图8为Kaplan-Meier法分析CA2血清浓度与肝癌病人术后复发的关系。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例中试剂来源：主要仪器实施例1：分泌蛋白组技术检测肝癌病人癌组织的分泌蛋白CA2浓度明显高于癌旁组织和远癌组织分泌浓度。1.检测样本：选取福建医科大学孟超肝胆医院肝胆外科2013年11月～2014年12月收治的术前未经过手术治疗或化疗的初治肝癌病人的组织培养上清提取的分泌蛋白。2.检测方法：(1)置换裂解液，进行FASP酶解；(2)上述病人组织培养上清提取分泌蛋白酶解肽段定量100μg，按照iTRAQ试剂盒说明书分别用iTRAQ试剂113标记所有远癌组织分泌蛋白的混合物，用于内参校正，114-119用于个体样本的标记(肝癌组织，癌旁组织和远癌组织，2个生物学重复)，共进行5个iTRAQ试剂盒标记，共计10个生物学重复，10个技术重复，然后混合、冻干；(3)用Sep-PakVacC18萃取柱对标记后的肽段进行脱盐；(4)脱盐后的肽段用95％H2O+5％ACN，PH＝10重悬，然后采用连接到C18反相柱的HPLC(高效液相色谱)系统进行高pH值下分离，收集80管馏分；(5)每个馏分用32μL0.1％FA+99.9％H2O进行重悬，纳升液相分离，并用在线电喷雾串联质谱仪分析；(6)质谱数据采用ThermoScientificProteomeDiscovererversion1.4软件搜索，与UniprotKB人类蛋白质组数据库进行匹配；(7)生物信息分析用SecretomeP2.0Server软件检测信号肽、预测分泌蛋白；用Scaffold_4.3.2软件获取定量蛋白质列表和各分泌蛋白各组样品表达量，绘制蛋白差异性表达谱，筛选显著性差异表达分泌蛋白。3.检测结果：CA2在C/F组(肝癌组织比远癌组织)、P/F组(癌旁组织比远癌组织)中均表达上调，在两组共同表达差异分泌蛋白中肽段比值分别为2.50、3.09，表明CA2表达水平的改变对肝癌的发生及其生物学行为有重要影响。实施例2：血清蛋白质组学技术检测肝癌病人复发前血清蛋白CA2浓度明显高于未复发病人浓度。1.检测样本：分别收集福建医科大学孟超肝胆医院4例肝癌病人(A、B、C、D)根治术后1，3，6，9月随访血清。对符合要求的病人抽取空腹静脉血5mL至生化管，冰盒取回后3000rpm，4℃离心10分钟，取上层血清分装后保存于-80℃冰箱。2.检测方法：(1)采用安捷伦多重亲和去除系统MARS-Human14液相色谱柱去除血清中的高丰度蛋白；(2)每组血清定量100μg，按照iTRAQ试剂盒说明书进行胰蛋白酶酶解。用2个iTRAQ试剂盒，病人A、B低丰度蛋白肽段用一个iTRAQ试剂盒，病人C、D低丰度蛋白肽段用一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.血清CA2(Carbonic Anhydrase II)蛋白在制备肝癌诊断或预后评估试剂盒中的应用。
【技术特征摘要】
1.血清CA2(CarbonicAnhydraseII)蛋白在制备肝癌诊断或预后评估试剂盒中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述试剂盒以血清CA2蛋白的特征肽段为检测标志物。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述血清CA2蛋白的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘景丰，刘小龙，邢晓华，孙颖，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，福建医科大学孟超肝胆医院，
类型：发明
国别省市：福建,35
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