The present invention provides a pre packaged Polio virus type D antigen detection method for mass production of poliovirus type II, using bovine (rabbit and sheep) to purify a microporous plate against type II poliovirus D antigen of type II, and prepare a precoated plate after protection of the coated plate and the coated antibody by a protective agent. Meanwhile, horseradish peroxidase labelled bovine (rabbit and goat) anti type II poliovirus enzyme labelled antibodies and other reagents were also used. This method (reagents) can be used for specific and quantitative detection of poliovirus type II D antigen, and no cross between poliovirus type II C antigen, type I, type III C, D antigen and other enterovirus. It is a kind of high specific, sensitive, convenient and widely used type of poliovirus D. The original detection method has a high application value in the IPV vaccine production test.
【技术实现步骤摘要】
一种脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用
本专利技术属于生物工程
,具体涉及一种脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用。
技术介绍
脊髓灰质炎病毒(poliovirus)属于小核糖核酸病毒科、肠道病毒属,分3个血清型,其主要侵犯脊髓前角灰质区运动神经元,临床特征为弛缓性肌肉麻痹,多发生在5岁以下儿童,尤其是婴幼儿,故亦称小儿麻痹症,是WHO继天花之后要消灭的第二种传染病的主要病原体。脊髓灰质炎病毒感染后没有特效的治疗手段,只能通过疫苗进行预防,目前用于预防控制脊灰流行的疫苗有两种:脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)和灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV),OPV因易于接种,成本相对较低而一度被广泛使用,但在长期使用过程中发现,其可能引起脊灰疫苗相关麻痹(VAPP)病例和疫苗衍生株脊灰病毒VDPV),IPV则能有效避免VAPP和VDPV的发生。因此,彻底消灭脊灰病毒最终需要用IPV全部取代OPV进行预防控制。脊髓灰质炎病毒共有3个血清型,分别为PolioⅠ型、PolioⅡ型和PolioⅢ型,3个型别的病毒颗粒均有2种形式,分别为具有感染性的完整病毒颗粒形式的D抗原和不具有感染性的空心颗粒C抗原。C抗原通过D抗原感染细胞过程、加热、紫外线照射、碱变性、毒力降解而产生,其VP4消失而无感染性。D抗原具有免疫原性,可诱导机体产生保护性中和抗体,从而预防脊髓灰质炎的发生,而C抗原虽有组特异性,但免疫血清尚不能中和病毒,由于D抗原含量与灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)接种后机体产生免疫效力之间具有较好的一致性,因此,D抗原作为IPV疫苗的 ...
【技术保护点】
1.一种脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原快速定性、定量检测方法,用于非临床疾病诊断治疗和非健康状况判断用途,其特征在于,包括以下步骤:S1、对动物抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒抗体进行制备并纯化,得动物抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原的纯化抗体;S2、用辣根过氧化物酶通过高碘酸钠法对动物抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原的纯化抗体进行标记,得动物抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原的检测用酶标抗体,制成酶标抗体使用液;S3、以动物抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原的纯化抗体进行酶标检测板的预包被处理,预包被处理中加入保护剂进行封闭保护;所述保护剂包括但不限于以下成分:BSA、明胶、酪蛋白、白蛋白、海藻糖、磷酸盐、碳酸盐中的一种或多种,制得预包被载体;,所得预包被载体能批量制作且能满足检测条件指标下实现长期存放;S4、采用预包被载体捕获待检抗原形成抗原抗体复合物,再与酶标记抗体使用液结合,通过底物催化酶显色,根据显色结果完成对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原的定性检测或定量检测。
【技术特征摘要】
1.一种脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原快速定性、定量检测方法,用于非临床疾病诊断治疗和非健康状况判断用途,其特征在于,包括以下步骤:S1、对动物抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒抗体进行制备并纯化,得动物抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原的纯化抗体;S2、用辣根过氧化物酶通过高碘酸钠法对动物抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原的纯化抗体进行标记,得动物抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原的检测用酶标抗体,制成酶标抗体使用液;S3、以动物抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原的纯化抗体进行酶标检测板的预包被处理,预包被处理中加入保护剂进行封闭保护;所述保护剂包括但不限于以下成分:BSA、明胶、酪蛋白、白蛋白、海藻糖、磷酸盐、碳酸盐中的一种或多种,制得预包被载体;,所得预包被载体能批量制作且能满足检测条件指标下实现长期存放;S4、采用预包被载体捕获待检抗原形成抗原抗体复合物,再与酶标记抗体使用液结合,通过底物催化酶显色,根据显色结果完成对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原的定性检测或定量检测。2.根据权利要求1所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原快速定性、定量检测方法,其特征在于,步骤S3中所述保护剂为:每1000ml保护剂包含7~13gBSA,7~13海藻糖、3~7g明胶,1~2g酪蛋白,30~70mMol磷酸盐溶液;所述预包被载体使用抽真空包装后存放。3.根据权利要求2所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原快速定性、定量检测方法,其特征在于,纯化抗体的制备步骤包括:1)Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原抗血清制备:将灭活脊髓灰质炎病毒通过10-30%蔗糖密度梯度离心,收集D抗原层,经电镜检测确认为Ⅱ型D抗原后用于免疫血清制备;试验动物牛、兔或羊,首免,Ⅱ型单价灭活病毒D抗原与福氏佐剂等量混匀,皮下注射免疫,进行3次加强免疫后采血,分离血清,采用微量中和试验进行血清中和抗体滴度测定;2)牛、兔或羊抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原纯化抗体制备:取蛋白A/G亲和层析柱,室温放置平衡30分钟,用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡;将抗血清与平衡液等体积比混合后上样,用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白,保留目的蛋白;用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来,收集洗脱峰,脱盐后备用;用lowrry法测定蛋白含量,得牛、兔或羊抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原纯化抗体,-20℃以下保存待用。4.根据权利要求1所述的一种脊髓灰质炎病毒Ⅱ型D抗原快速定性、定量检测方法,其特征在于,所述S2步骤包括:将辣根过氧化物酶用注射用水溶解后,加入NaIO4,静置,加入乙二醇溶液,静置,再与步骤S1所得纯化抗体混合,透析过夜;加硼氢化钠,静置,加饱和硫酸铵,离心;取沉淀溶解后透析过夜;得到牛或兔或羊抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒D抗原检测用酶标抗体,低温保存备用。5.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员:龙润乡,谢忠平,罗芳宇,杨蓉,陈洪波,岳磊,谢天宏,李华,杨婷,王正鑫,
申请(专利权)人:中国医学科学院医学生物学研究所,
类型:发明
国别省市:云南,53
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