一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器及其应用。本发明专利技术的荧光生物传感器含有高梯度磁分离装置和荧光检测系统，高梯度磁分离装置由环形磁铁阵列、磁铁支架、圆环通道和铁珠链组成；环形磁铁阵列和磁铁支架构成环形磁场生成器，每相邻两个磁铁相互排斥组装；圆环通道是由两个嵌套在一起的内毛细管和外毛细管组成，两个毛细管同轴固定后嵌套在环形磁铁阵列的同心圆内，内毛细管中填充有软磁材料的铁珠链，该铁珠链可被环形磁场磁化，使纳米磁珠均匀分布在圆环通道内，用于捕获目标物。本发明专利技术的荧光生物传感器可用于定量检测微生物，操作简单，分离效率高，灵敏度好，可在2小时内实现食品样本中少量目标细菌的定量检测。

A fluorescence biosensor based on high gradient magnetic separation and quantum dots and its application

The invention provides a fluorescent biosensor based on high gradient magnetic separation and quantum dots and its application. The fluorescent biosensor contains a high gradient magnetic separation device and a fluorescence detection system. The high gradient magnetic separation device consists of a ring magnet array, a magnet bracket, a ring channel and an iron bead chain. A ring magnet array and a magnet bracket constitute a circular magnetic field generator. Each adjacent two magnets are excluded from each other. The channel is composed of two inner and outer capillaries which are nested together. The two capillaries are fixed in the concentric circle of the ring magnet array, and the inner capillary is filled with the iron bead chain with soft magnetic material. The iron bead chain can be magnetized by the ring magnetic field, so that the nanomagnetic beads are evenly distributed in the ring channel and used to capture the eyes. The object. The fluorescent biosensor of the invention can be used for quantitative detection of microbes, with simple operation, high separation efficiency and good sensitivity, and can realize quantitative detection of a small amount of target bacteria in food samples within 2 hours.

【技术实现步骤摘要】
一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器及其应用
本专利技术涉及生物检测
，更具体地，涉及一种基于高梯度磁分离和量子点的微生物检测方法。
技术介绍
近年来食品安全问题受到国际社会的广泛关注，在我国病原微生物是造成食品中毒的最主要因素，已严重威胁到了人民健康，并造成了巨大的经济损失。预防和控制食源性疾病爆发的一个关键是微生物污染食品的快速筛查。现有的细菌检测方法主要有培养法(对细菌而言)或分离法(对病毒而言)、免疫学方法(如ELISA)、分子生物学方法(如PCR)。传统的培养或分离法是金标准方法，准确性及灵敏度高，但耗时长；ELISA检测时间较短，特异性较好，易实现高通量，但灵敏度较低和假阳性率偏高；PCR检测时间也较短，灵敏度较高，但核酸提取操作复杂，且需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员。荧光生物传感器是一种新型生物检测技术，具有灵敏度高、操作简单和非接触检测等优点，已被广泛报道用于病原微生物检测。量子点是一种常用的荧光材料，具有激发光谱宽、发射光谱窄、斯托克斯位移较大、光化学稳定性高和荧光寿命长等特点，常用于灵敏的生物检测分析。由于很多实际样本，如食品、粪便等，具有很复杂的背景，易造成假信号，因此将目标物从复杂样品溶液中分离出来是非常有必要的，也是目前亟需解决的一个关键问题。传统的过滤法和离心法是基于目标物的尺寸和质量进行分离，没有特异性，而近年来发展起来的免疫磁分离法是基于抗原抗体免疫反应，利用免疫磁珠和外加磁场将目标物从样本背景中分离出来并富集，虽然具有特异性，但这种方法通常只能处理小体积样本，且基本上都是手动操作，对操作人员要求较高。因此，开发一种分离效率较高、特异性较好的大体积样本微生物分离方法并与无接触检测、灵敏性较高的荧光生物传感器相结合应用于微生物检测具有重要意义。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术要解决的技术问题是研究一种大体积样本目标物特异分离和富集方法，并与荧光检测相结合，提高微生物或其他目标物的检测灵敏度和自动化操作水平，且缩短检测时间。(二)技术方案为了解决上述问题，本方法设计的高梯度磁场，可进行大体积样本免疫磁分离，操作步骤较简单；本专利技术提供了一种基于高梯度磁分离的荧光生物传感器，用来快速检测微生物，该荧光生物传感器含有高梯度磁分离装置，该高梯度磁场分离装置由环形磁铁阵列、磁铁支架、圆环通道和铁珠链组成；其中，环形磁铁阵列和磁铁支架构成环形磁场生成器，所述环形磁铁阵列由多个规格相同的环形磁铁组成，并以圆心为中心轴相邻排列，每相邻两个环形磁铁是处于相互排斥状态；所述圆环通道是由两个嵌套在一起的内毛细管和外毛细管组成，内毛细管中填充有直线排列的软磁材料铁珠链，两个毛细管同轴固定后嵌套在环形磁铁阵列的同心圆中。在本申请的实施例中，环形磁场生成器包括96个环形磁铁和与之相对应以固定环形磁铁的磁铁支架，本领域技术人员应当理解，环形磁铁数目可多可少，不局限于本申请实施例所述的数量。所述环形磁铁的内径稍大于外毛细管的直径，确保外毛细管能够嵌入环形磁铁内径并保持与环形磁铁的紧密接触，环形磁铁的厚度为0.5-1.3mm，优选1.0mm；所述磁铁支架上均匀设置有用于固定环形磁铁的磁铁槽，每两个磁铁槽间隔为0.4-0.8mm，优选0.5mm。本专利技术的实施例中，环形磁铁的外径为5.5mm，内径为2.8mm，环形磁铁的厚度为1.0mm；所述磁铁支架长130mm，宽9.5mm，每个磁铁槽厚度为1.1mm，每两个磁铁槽间隔为0.5mm。所述内毛细管的内径为0.9-1.5mm，优选1.2mm，外径为1.2-1.8mm，优选1.5mm，外玻璃管的内径为1.5-2.1mm，优选1.8mm，外径为1.8-2.4mm，优选2.1mm；所述内毛细管、外毛细管的材质为石英玻璃、普通玻璃或有机玻璃。所述软磁材料铁珠链使用的铁珠的直径小于内毛细管的内径，二者差距在0.1-0.5mm之间，优选地，软磁材料铁珠链的直径为1.0mm。所述软磁材料铁珠链可被环形磁场磁化，产生独特的环形高梯度磁场，避免磁珠聚团，均匀地分散在圆环通道内。本专利技术还提供了上述荧光生物传感器在微生物检测中的应用。所述的应用，包括以下步骤：(1)将偶联蛋白G或蛋白A的磁珠注入圆环通道中，所述磁珠会被高梯度磁场捕获，均匀分布在圆环通道中，再注入目标物生物识别材料，生物识别材料与蛋白G或蛋白A孵育结合后，形成免疫磁珠，之后清洗除去多余抗体；(2)向圆环通道中注入含有目标物的样本溶液，磁珠上的目标物生物识别材料捕获目标物，之后清洗除去样本背景，得到纯化和富集的磁珠-目标物复合体；(3)向所述圆环通道中注入免疫量子点，所述磁珠-目标物复合体与免疫量子点发生免疫结合，形成磁珠-目标物-量子点复合物，之后清洗除去多余免疫量子点；(4)将圆环通道从环形磁场发生器中取出，并将磁珠-目标物-量子点复合物从圆环通道中冲洗出来并回收，之后利用荧光检测系统进行检测，得到荧光强度值，最后利用标定曲线计算目标物的浓度。其中，步骤(1)的偶联蛋白G或蛋白A的磁珠溶于磷酸盐缓冲液中，用精密蠕动泵将其以1.1-1.3mL/min的高流速注入圆环通道中。本申请实施例所用的蠕动泵型号是T60-S2&WX10-14-A。步骤(1)中，蛋白G或蛋白A可与目标物抗体的Fc段特异性结合，形成免疫磁珠；注入超纯水冲洗除去多余的抗体。步骤(1)所述的目标物生物识别材料为目标物的单克隆抗体、核酸适配体、噬菌体或凝集素。本申请的实施例中，选用目标物的单克隆抗体作为目标物生物识别材料。步骤(2)向圆环通道中注入含有目标物的样本溶液，循环3遍。利用免疫磁珠上的所述抗体对目标物进行捕获，形成磁珠-目标物复合体；注入超纯水冲清洗除去其它微生物和杂质。所述步骤(3)包括以下步骤：1)所述免疫量子点的制备是先将链霉亲和素化的量子点和生物素化的抗体进行混合孵育，再离心除去多余抗体；2)将免疫量子点注入圆环通道，与磁珠-目标物复合体孵育后，形成磁珠-目标物-量子点复合物；注入超纯水冲清洗除去多余的免疫量子点。所述目标物识别材料和所述生物素化的抗体与目标物的结合位点不同，也即：免疫磁珠上修饰的抗体和所述免疫量子点上修饰的抗体与目标物的结合位点不同，是两个配对的抗体。(三)有益效果实现了大体积样本中目标物的特异分离，具有较高的分离效率和检测灵敏度以及较简单的操作步骤，可在2小时内实现待测样品中少量微生物的定量检测。1、本专利技术提供了一种基于高梯度磁场分离的荧光生物传感器，具有较高的目标物分离效率，检测灵敏度高，方法简单易操作。2、本专利技术的高梯度磁分离装置能够使磁珠均匀分布在环形通道内，避免了免疫磁珠聚团，大幅度提高了目标物分离效率，其目标物的分离效率高于传统的磁分离器的分离效率，更重要的是可以用于大体积样本分离；3、利用本专利技术的荧光生物传感器可以提高检测速度，可在2小时内实现大体积样本中少量微生物的定量检测；4、利用本专利技术荧光生物传感器检测牛奶真实样品中的目标物，得到的回收率为95.92％～108.15％。附图说明图1为本专利技术基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器快速检测微生物方法的流程图。图2a为本专利技术荧光生物传感器的高梯度磁分离装置中的圆环通道示意图。图2b为本专利技术荧光生物传感器移去磁铁支架本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器，其特征在于，含有高梯度磁分离装置，该高梯度磁分离装置由环形磁铁阵列、磁铁支架、圆环通道和铁珠链组成；其中，环形磁铁阵列和磁铁支架构成环形磁场生成器，所述环形磁铁阵列由多个规格相同的环形磁铁组成，并以圆心为中心轴相邻排列，每相邻两个环形磁铁是处于相互排斥状态；所述圆环通道是由两个嵌套在一起的内毛细管和外毛细管组成，内毛细管中填充有直线排列的软磁材料铁珠链，两个毛细管同轴固定后嵌套在环形磁铁阵列的同心圆中。

【技术特征摘要】
1.一种基于高梯度磁分离和量子点的荧光生物传感器，其特征在于，含有高梯度磁分离装置，该高梯度磁分离装置由环形磁铁阵列、磁铁支架、圆环通道和铁珠链组成；其中，环形磁铁阵列和磁铁支架构成环形磁场生成器，所述环形磁铁阵列由多个规格相同的环形磁铁组成，并以圆心为中心轴相邻排列，每相邻两个环形磁铁是处于相互排斥状态；所述圆环通道是由两个嵌套在一起的内毛细管和外毛细管组成，内毛细管中填充有直线排列的软磁材料铁珠链，两个毛细管同轴固定后嵌套在环形磁铁阵列的同心圆中。2.如权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述环形磁铁的内径稍大于外毛细管的直径，确保外毛细管能够嵌入环形磁铁内径并保持与环形磁铁的紧密接触，环形磁铁的厚度为0.5-1.3mm，优选1.0mm；所述磁铁支架上均匀设置有用于固定环形磁铁的磁铁槽，每两个磁铁槽间隔为0.4-0.8mm，优选0.5mm。3.如权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述内毛细管的内径为0.9-1.5mm，优选1.2mm，外径为1.2-1.8mm，优选1.5mm，外玻璃管的内径为1.5-2.1mm，优选1.8mm，外径为1.8-2.4mm，优选2.1mm；所述内毛细管、外毛细管的材质为石英玻璃、普通玻璃或有机玻璃。4.如权利要求1-3任一所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述软磁材料铁珠链使用的铁珠的直径小于内毛细管的内径，二者差距在0.1-0.5mm之间。5.权利要求1-4任一所述的荧光生物传感器，其特征在于，当所述圆环通道置于所述环形磁场生成器中时，所述铁珠链将被磁化，并在所述铁珠链周围产生高梯度磁场，其应用如下：(1)将偶联蛋白G或蛋白A的磁珠注入所述圆环通道中，所述磁珠会被高梯度磁场捕获，均匀分布在圆环通道中，再注入目标物生物识别材料，生物识别材料与蛋白G或蛋白A孵育结合后，形成免疫磁珠，之后清洗除去多余抗体；(2)向所述圆环通道中注入含有目标物的样本溶液，磁珠上的目标物生物识别材料捕获目标物，之后...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建涵，薛丽，张慧林，奚欣格，郑玲燕，蔡杲哲，王蕾，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11