The preparation and application of a highly efficient and stable magnetic immune microsphere are used for the preparation of magnetic immuno microspheres, which is convenient and controllable. By mixing the pre activated magnetic microspheres with the antigen or antibody with cysteine, the magnetic immunological microspheres are prepared and used for enzyme linked immunosorbent assay. The magnetic microspheres coupled with antigen / antibody can be quickly prepared, and the coupling can also be preserved for a long time, which saves the time and cost of detection and improves the flux of detection. The invention can also significantly improve the detection sensitivity. The experimental results show that the magnetic enzyme linked immunosorbent assay is the coupling of small molecular antigen to the active magnetic microspheres, which can be directly detected by ELISA, saving time and cost, and will have extensive application prospects and produce good economic benefits.
【技术实现步骤摘要】
一种高效、稳定的磁性免疫微球的制备和应用
本专利技术涉及生物医药领域,具体是一种高效、稳定的磁性免疫微球的制备和应用。
技术介绍
酶联免疫吸附(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay;ELISA)是一种利用酶催化生色在固相材料的表面检测抗体和抗原之间结合的技术方法,这种方法广泛应用于科学研究、医学检测、环境保护、食品安全等许多方面。1971年专利技术以来,经典的ELISA方法获得了各种改进,包括方法学的改进、材料的改进、检测用酶以及底物的改进等等,极大的提高了检测的灵敏度以及操作的便利与可靠性。利用化学合成的表位多肽制备抗体是一种规模化抗体制备的技术手段,一次可以制备成千上万种特定抗原的抗体。这一方法目前常规的操作方法是:1)利用生物学软件获取需要制备的抗原信息(通常是蛋白质序列)建立需要制备抗体的蛋白质组的数据库;2)利用软件对数据库里面的蛋白质序列进行单独分析,预测其特定的线性B细胞表位氨基酸序列,根据序列设计需要制备抗体的多肽序列;3)化学合成多肽,并将多肽偶联到牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)等具有免疫刺激作用的载体蛋白上,获得偶联多肽用作抗原;4)利用偶联后的抗原免疫适龄的实验兔,多次加强免疫后,获得抗血清;5)利用多肽或者偶联多肽包板,进行ELISA实验,测定抗血清中特定抗体的效价,筛选效价达标的抗血清;6)使用不同的策略对抗血清进行纯化,包括抗原亲和纯化、ProteinA纯化、盐析沉淀纯化等多种方法。在上述第5)步中,存在3个问题:1)使用偶联多肽包板,可以获得很好的稳定性,但是偶联多肽的 ...
【技术保护点】
1.一种高效、稳定的磁性免疫微球的制备,其特征在于,步骤如下:1)磁性微球的选择:磁性免疫微球的制备中,所使用的磁性微球为预活化的磁性微球;2)氨基磁性微球制备:反应体系中磁性微球占30%‑50%,环氧氯丙烷占5‑20%,1‑2M的NaOH,2mg/ml的硼氰化钠,反应温度为20‑40℃,反应时间2‑6小时,去离子水洗至无环氧氯丙烷后,加入5%氨水并在20‑40℃反应10‑24小时,然后去离子水清洗即为氨基磁性微球;3)预活化微球制备:取步骤2)制备的氨基磁性微球100ml,加入100ml去离子水、6‑15g碘乙酸或溴乙酸,再加50%的NaOH调节pH至4.0‑6.0,然后加入10g的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺(EDC),在15‑30℃的温度下反应1小时后,再调pH至4.0‑6.0后继续反应2‑5小时,即为预活化微球。4)取步骤3)制备的预活化微球10ml,加入10ml含自由巯基的0.1‑1mg/ml抗原溶液,偶联液为50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris),5mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA‑Na),pH 8.0‑8.5,在20‑40℃的温度下反应30‑60min;5)将步 ...
【技术特征摘要】
1.一种高效、稳定的磁性免疫微球的制备,其特征在于,步骤如下:1)磁性微球的选择:磁性免疫微球的制备中,所使用的磁性微球为预活化的磁性微球;2)氨基磁性微球制备:反应体系中磁性微球占30%-50%,环氧氯丙烷占5-20%,1-2M的NaOH,2mg/ml的硼氰化钠,反应温度为20-40℃,反应时间2-6小时,去离子水洗至无环氧氯丙烷后,加入5%氨水并在20-40℃反应10-24小时,然后去离子水清洗即为氨基磁性微球;3)预活化微球制备:取步骤2)制备的氨基磁性微球100ml,加入100ml去离子水、6-15g碘乙酸或溴乙酸,再加50%的NaOH调节pH至4.0-6.0,然后加入10g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC),在15-30℃的温度下反应1小时后,再调pH至4.0-6.0后继续反应2-5小时,即为预活化微球。4)取步骤3)制备的预活化微球10ml,加入10ml含自由巯基的0.1-1mg/ml抗原溶液,偶联液为50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris),5mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na),pH8.0-8.5,在20-40℃的温度下反应30-60min;5)将步骤4)反应后产物,再加入50mM的Tris封闭液,5mM的EDTA-Na,50mM的L-半胱氨酸,pH调节至8.5,在37℃的温度下反应1小时,即为偶联抗原的磁性免疫磁珠。2.根据权利要求1所述的一种高效、稳定的磁性免疫微球的应用,其特征在于:步骤1)中的磁性微球为...
【专利技术属性】
技术研发人员:单玉飞,曹飞婷,
申请(专利权)人:常州天地人和生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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