生物样本制备方法及其应用以及代谢物定性定量分析方法技术

本发明专利技术提供了用于在对来自生物体的生物体样本的中的代谢物进行气相色谱仪和质谱仪联用检测分析前，对生物样本进行处理得到前处理样本的生物样本前处理方法及其在代谢物检测中的应用、以及相应的代谢物检测分析方法，其中的生物样本前处理方法包括以下步骤：步骤1，提取处理；步骤2，衍生反应，采用辅助试剂以及衍生试剂对提取生物样本进行衍生反应得到衍生生物样本；步骤3，标准化并去杂，其中，辅助试剂中至少包括强碱性溶液和低温醇类有机溶剂，在步骤1中，先采用强碱性溶液再采用低温醇类有机溶剂对生物样本进行连续地提取处理。

Preparation methods and application of biological samples and qualitative and quantitative analysis of metabolites

The present invention provides a biological sample preprocessing method for processing samples of biological samples and its application in metabolite detection, as well as the corresponding metabolite detection and analysis method, before the detection analysis of the metabolites in the biological samples of organisms from the gas chromatograph and the mass spectrometer. The biological sample pretreatment methods include the following steps: Step 1, extraction treatment, step 2, derivative reaction, derivatization of derived biological samples with auxiliary reagents and derivatization reagents, step 3, standardization and impurity removal, in which the auxiliary reagent includes at least strong alkaline solution and Low temperature alcohols organic solvents, in step 1, first use strong alkaline solution and then use low-temperature alcohol organic solvents to extract biological samples continuously.

【技术实现步骤摘要】
生物样本制备方法及其应用以及代谢物定性定量分析方法
本专利技术属于化学领域，具体涉及一种用于在对来自生物体的生物体样本的中的代谢物进行气相色谱和质谱联用仪检测分析前，对生物样本进行处理得到前处理样本的生物样本制备方法及其在代谢物定性定量分析中的应用、以及相应的代谢物定性定量分析方法。
技术介绍
生物体中具有大量的各种途径产生的代谢物，一些是来自生物体本身代谢产生的，一些是生物体和生物体中的微生物群共同代谢产生的，还有一些是生物体中的微生物群自身代谢产生的。各个途径产生的代谢物发挥各自的功能，相互协同作用于生物体的整体机能，所以如何检测到更多的代谢物以进一步地分析，成为当今代谢物分析的重要研究目标。而各种途径产生的代谢物浓度差异巨大，理化性质上也千差万别，特别是人体(生物体)的肠道菌在生物体(宿主)中产生的代谢物、以及肠道菌与生物体(宿主)共同代谢产生的共代谢物，包括短链脂肪酸、氨基酸、苯甲酰和苯基衍生物、吲哚衍生物、脂类、胆汁酸、胆碱、维生素以及多胺类等，它们有截然不同的物理和化学性质，因此如何用尽可能少的平台同时测定尽可能多的代谢物极具挑战。目前，尚未有方法能够同时检测上述提及到短链脂肪酸、氨基酸、苯甲酰和苯基衍生物、吲哚衍生物、脂类、胆汁酸、胆碱、维生素以及多胺类等多种小分子代谢物。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于在对来自生物体的生物体样本的中的代谢物进行气相色谱和质谱联用仪检测分析前，对生物样本进行处理得到前处理样本的生物样本制备方法及其在代谢物定性定量分析中的应用、以及相应的代谢物定性定量分析方法。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术提供了一种生物样本制备方法，用于在对来自生物体的生物样本进行前处理得到能用于代谢物进行气相色谱和质谱联用仪检测分析的前处理样本，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，提取处理，对预定量的生物样本进行代谢物的提取得到提取生物样本；步骤2，衍生反应，采用辅助试剂以及衍生试剂对提取生物样本进行衍生反应得到衍生生物样本；步骤3，标准化并去杂，向衍生样本中加入由多种直链烷烃标准品混合得到的保留指数标准物质混合物后，进行去杂得到前处理样本，其中，辅助试剂中至少包括强碱性溶液和低温醇类有机溶剂，在步骤1中，先采用强碱性溶液再采用低温醇类有机溶剂对生物样本进行连续地提取处理。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，强碱性溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水溶液中的一种。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，强碱溶液的浓度为1M，步骤1具体为：步骤1.1，第一次提取，取预定量的生物样本于离心管中，将强碱性溶液按每1mg生物样本加入30μL的比例加入到生物样本中进行匀浆，然后在温度为4℃、离心力为16000g的条件下离心20min，取离心得到的第一次上清液装入进样小瓶中；步骤1.2，第二次提取，向取第一次上清液后剩余的残留物中按每1mg生物样本加入20μL的比例加入低温醇类有机溶剂清洗后，再次匀浆和离心，取离心得到的第二次上清液加入进样小瓶中与第一次上清液合并得到提取生物样本。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，预定量为1-500mg。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，预定量为100-500mg。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，预定量为1-50mg。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，辅助试剂中还包括吡啶溶液，衍生试剂为氯甲酸甲酯试剂，步骤2具体为：取提取生物样本置于4℃托盘中，将吡啶溶液和氯甲酸甲酯试剂按体积比为1.7:1加入，在2,500-3,000rpm的振动条件下振摇30s得到衍生生物样本。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，生物样本为生物体的粪便、鼻分泌物、阴道分泌物或肠内容物中的一种多种。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：步骤3具体为：步骤3.1，将保留指数标准物质混合物加入到氯仿溶液中得到含保留指数标准品氯仿溶液；步骤3.2，将将含保留指数标准品氯仿溶液按与衍生生物样本的体积比为第一预定体积比的比例加入到衍生生物样本中，在2,500-3,000rpm的振动条件下，振摇10s，得到标混样本；步骤3.3，按与标混样本的体积比为第二预定体积比的比例加入浓度为50mM的NaHCO3溶液加入到标混样本中,在2,500-3,000rpm的振动条件下振摇10s，在温度为4℃、离心力为2000g的条件下离心10min以分层得到分层溶液；步骤3.4，将分层溶液中位于分层底部的氯仿层转入含100mg无水硫酸钠的气相样品瓶中作为前处理生物样本。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，第一预定体积比为1:1。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，第二预定体积比为1:2。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，保留指数标准物质混合物包括从C8-C30的直链烷烃标准品。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，所述代谢物为宿主体内的微生物群在宿主中代谢产生的代谢物或微生物群与宿主共同代谢产生的共代谢物或者是以上两种的总和。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：宿主为人体，微生物群为人体中的肠道菌群。本专利技术提供的生物样本制备方法，还具有这样的特征：其中，所述代谢物为脂肪酸、苯基类、吲哚类、脂类、胆汁酸、胆碱、维生素或多胺类中的一种或多种。本专利技术还提供一种生物样本制备方法在代谢物定性定量分析中的应用，其特征在于：其中，生物样本制备方法为上述的生物样本制备方法。本专利技术还提供一种代谢物定性定量分析方法，通过气相色谱和质谱联用仪对来自生物体的生物样本进行检测分析得到待分析信息，以对生物体中的代谢物进行分析，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，生物样本前处理，对生物样本进行前处理得到前处理生物样本；步骤二，检测采集信息，通过气相色谱和质谱联用仪对前处理生物样本进行检测而采集得到与代谢物对应的待分析信息；步骤三，定性定量分析，基于包括与不同标准物质的衍生物分别相对应的不同质谱信息的标准数据库，对待分析信息进行定性定量分析，其中，步骤一采用述的生物样本制备方法进行。本专利技术提供的代谢物定性定量分析方法，还具有这样的特征：在步骤二中，气相色谱仪的温度控制采用程序升温方法：初始温度为35-45℃，保持1min-2min，以10℃/min-25℃/min的速率上升到260℃-300℃，然后以40℃/min的速率上升到290℃-320，保持2min-5min，总时间为15.25min-28.25min。本专利技术提供的代谢物定性定量分析方法，还具有这样的特征：气相色谱仪的条件为：色谱柱为毛细管色谱柱，长度为30m，内径为0.25mm，填充材料为交联二苯基二甲基聚硅氧烷、中极性交联相或低中极性相中的一种，填充厚度为1.4μm-0.25mm，使用温度的范围为-60℃-350℃；进样口温度为270℃；传输管温度为270℃。本专利技术提供的代谢物定性定量分析方法，还具有这样的特征：所述气相色谱仪的条件为：色谱柱为毛细管色谱柱，长度为30m，内径为0.25mm，填充材料为交联二苯基二甲基聚硅氧烷、中极性交联相或低中极性相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物样本制备方法，用于在对来自生物体的生物样本进行前处理得到能用于代谢物进行气相色谱和质谱联用仪检测分析的前处理样本，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，提取处理，对预定量的所述生物样本进行代谢物的提取得到提取生物样本；步骤2，衍生反应，采用辅助试剂以及衍生试剂对所述提取生物样本进行衍生反应得到衍生生物样本；步骤3，标准化并去杂，向所述衍生样本中加入由多种直链烷烃标准品混合得到的保留指数标准物质混合物后，进行去杂得到所述前处理样本，其中，所述辅助试剂中至少包括强碱性溶液和低温醇类有机溶剂，在步骤1中，先采用所述强碱性溶液再采用所述低温醇类有机溶剂对所述生物样本进行连续地提取处理。

【技术特征摘要】
2017.04.24 CN 20171027203011.一种生物样本制备方法，用于在对来自生物体的生物样本进行前处理得到能用于代谢物进行气相色谱和质谱联用仪检测分析的前处理样本，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，提取处理，对预定量的所述生物样本进行代谢物的提取得到提取生物样本；步骤2，衍生反应，采用辅助试剂以及衍生试剂对所述提取生物样本进行衍生反应得到衍生生物样本；步骤3，标准化并去杂，向所述衍生样本中加入由多种直链烷烃标准品混合得到的保留指数标准物质混合物后，进行去杂得到所述前处理样本，其中，所述辅助试剂中至少包括强碱性溶液和低温醇类有机溶剂，在步骤1中，先采用所述强碱性溶液再采用所述低温醇类有机溶剂对所述生物样本进行连续地提取处理。2.根据权利要求1所述的生物样本制备方法，其特征在于：其中，所述强碱性溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水溶液中的一种。3.根据权利要求2所述的生物样本制备方法，其特征在于：其中，所述强碱溶液的浓度为1M，所述步骤1具体为：步骤1.1，第一次提取，取预定量的所述生物样本于离心管中，将所述强碱溶液溶液按每1mg所述生物样本加入30μL的比例加入到所述生物样本中进行匀浆，然后在温度为4℃、离心力为16000g的条件下离心20min，取离心得到的第一次上清液装入进样小瓶中；步骤1.2，第二次提取，向取第一次上清液后剩余的残留物中按每1mg所述生物样本加入20μL的比例加入所述低温醇类有机溶剂清洗后，再次匀浆和离心，取离心得到的第二次上清液加入所述进样小瓶中与所述第一次上清液合并得到所述提取生物样本。4.根据权利要求1至3任意一项所述的生物样本制备方法，其特征在于：其中，所述预定量为1-500mg。5.根据权利要求4所述的生物样本制备方法，其特征在于：其中，所述预定量为100-500mg。6.根据权利要求4所述的生物样本制备方法，其特征在于：其中，所述预定量为1-50mg。7.根据权利要求1所述的生物样本制备方法，其特征在于：其中，所述辅助试剂中还包括吡啶溶液，所述衍生试剂为氯甲酸甲酯试剂，所述步骤2具体为：取所述提取生物样本置于4℃托盘中，将所述吡啶溶液和所述氯甲酸甲酯试剂按体积比为1.7:1加入，在2,500-3,000rpm的振动条件下振摇30s得到所述衍生生物样本。8.根据权利要求1至3以及7中任意一项所述的生物样本前处理方法，其特征在于：其中，所述生物样本为所述生物体的粪便、鼻分泌物、阴道分泌物或肠内容物中的一种多种。9.根据权利要求1所述的生物样本制备方法，其特征在于：步骤3具体为：步骤3.1，将保留指数标准物质混合物加入到氯仿溶液中得到含保留指数标准品氯仿溶液；步骤3.2，将所述将含保留指数标准品氯仿溶液按与所述衍生生物样本的体积比为第一预定体积比的比例加入到所述衍生生物样本中，在2,500-3,000rpm的振动条件下，振摇10s，得到标混样本；步骤3.3，按与所述标混样本的体积比为第二预定体积比的比例加入浓度为50mM的NaHCO3溶液加入到所述标混样本中,在2,500-3,000rpm的振动条件下振摇10s，在温度为4℃、...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾伟，苏明明，赵琳静，倪艳，
申请(专利权)人：麦特绘谱生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31