一种快速检测藻细胞破裂程度的方法技术

本发明专利技术提供了一种快速检测微藻细胞破裂程度的方法，包括以下步骤：1)制备破碎处理的藻悬液待测样品；2)离心所述破碎藻悬液待测样品，获得上清液；测定所述步骤2)获得的上清液在425～450nm波长处的吸光度Ax或在670～690nm波长处的吸光值Ax’，根据预定的两处波长吸光度值对应的标准曲线计算得到待测样品的微藻细胞破裂程度CDx；所述标准曲线的获得方法为：测定破碎藻悬液在所述波长处的吸光度值、采用计数法计算得到所述藻悬液细胞的破裂程度，根据所述破碎藻悬液的吸光度值和细胞破裂程度，线性拟合得到标准曲线。本发明专利技术所述的方法简单、快速，并且测定结果稳定可靠。

A method for rapid detection of the degree of rupture of algae cells

The present invention provides a method for rapid detection of the degree of rupture of microalgae cells, including the following steps: 1) preparing the sample of the broken algae suspension to be measured; 2) centrifuging the sample of the broken algae suspension, obtaining the supernatant, determining the absorbance Ax of the supernatant at the length of the 425 to 450nm wave, or at the 670 ~ 690nm wave. The absorbance value of the length of Ax 'is calculated by the standard curve corresponding to the predetermined two wavelength absorbance values. The method of obtaining the standard curve is to determine the absorbance value of the broken algae suspension at the length of the wave and the counting method to calculate the rupture process of the algae suspension cells. According to the absorbance value of the broken algal suspension and the degree of cell breakage, the standard curve was fitted by linear fitting. The method described in the invention is simple and fast, and the determination result is stable and reliable.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测藻细胞破裂程度的方法
本专利技术属于微藻资源化利用领域
，具体涉及一种快速检测藻细胞破裂程度的方法。
技术介绍
微藻是一类在河湖、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养生物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。微藻生长周期短，能够快速培育获得，已经被认为是一种新型可再生资源，具有极高的利用价值，尤其是能够用于获取高附加值产物，如维生素、高级脂肪酸、生物活性物质等。有些微藻含脂量高达70％，甚至更高，是一种有效的生物柴油原料。然而，微藻的细胞体积较小，细胞壁较厚，导致直接从完整的细胞中提取胞内物质通常需要大量的能耗，这使得获取胞内物质的成本高昂，阻碍了微藻资源化利用的工业化进程。研究表明，将微藻预处理破裂后，能够快速有效地获取胞内物质。然而，微藻预处理破裂过程中存在藻细胞裂解不充分目标产物不能完全提取出来，或者藻细胞裂解过度导致目标产物被破坏的问题，不利于整个微藻资源化利用过程。如何快速有效地监测预处理过程中藻细胞破裂程度成为急需解决的问题。目前，国内外学者对于微藻预处理破裂过程中藻细胞破裂程度的检测方法大多采用镜检法，如采用血球计数板进行显微观察计数。该方法通常耗时耗力，且不同技术程度的人员观察计数结果之间具有差异，结果不稳定，无法快速、广泛运用于实际生产中。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种简单、快速稳定的检测微藻细胞破裂程度的方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种快速检测微藻细胞破裂程度的方法，包括以下步骤：1)制备破碎处理的藻悬液待测样品；2)离心所述破碎处理的藻悬液待测样品，获得上清液；测定所述步骤2)获得的上清液在425～450nm波长处的吸光度Ax或在670～690nm波长处的吸光值Ax’，根据预定的两处波长吸光度值对应的标准曲线计算得到待测样品的微藻细胞破裂程度CDx；所述标准曲线的获得方法为：测定破碎藻悬液标样在所述波长处的吸光度值、采用计数法计算得到所述破碎藻悬液标样的细胞破裂程度，根据所述破碎悬浮标样的吸光度值和破裂程度，线性拟合得到标准曲线。优选的，步骤2)中所述离心的转速为10000～15000g。优选的，步骤2)中所述离心时间为10～30min。优选的，步骤3)中检测上清液吸光度的波长为430～440nm或675～685nm。优选的，所述破碎藻悬液标样由超声波处理初始未破裂藻悬液样品不同时间获得所述不同破裂程度的微藻标样。优选的，未经过超声波处理的藻悬液的初始细胞浓度为103～107cells/mL。优选的，步骤2)中所述的超声波的频率为20～40kHz。优选的，步骤2)中所述超声波的功率为0.01～0.1W/cm3。优选的，步骤2)中所述超声波处理的时间为0～250min。优选的，步骤2)中所述超声波处理的温度为10～30℃。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的快速检测微藻细胞破裂程度的方法利用微藻细胞破裂后的上清液在425～450nm或670～690nm波长处的吸光值与微藻细胞的破裂程度呈线性关系，绘制标准曲线；然后测定任意破裂程度的藻悬液上清液在相应波长处的吸光值，代入标准曲线计算获得该处理时间微藻细胞的破裂程度。本专利技术所述的方法简单、快速，并且测定结果稳定。附图说明图1为实施例1和2中微藻细胞裂解率测定和绘制标线的流程图；图2为铜绿微囊藻细胞破裂率与其上清液吸光值的标准曲线；图3为莱茵衣藻细胞裂解率与其上清液吸光值的标准曲线。具体实施方式本专利技术提供了一种快速检测微藻细胞破裂程度的方法，包括以下步骤：1)制备破碎处理的藻悬液待测样品；2)离心所述破碎处理的藻悬液待测样品，获得上清液；测定所述步骤2)获得的上清液在425～450nm波长处的吸光度Ax或在670～690nm波长处的吸光值Ax’，根据预定的两处波长吸光度值对应的标准曲线计算得到待测样品的微藻细胞破裂程度CDx；所述标准曲线的获得方法为：测定破碎藻悬液标样在所述波长处的吸光度值、采用计数法计算得到所述破碎藻悬液标样的破裂程度，根据所述破碎悬浮标样的吸光度值和破裂程度，线性拟合得到标准曲线。在本专利技术中，所述破碎藻悬液待测样品为通过本领域常规的破碎方法获得的破碎藻悬液样品；所述常规的破碎方法优选的包括超声波破碎法，溶胀法、反复冻融法或玻璃珠破碎法。本专利技术提供的方法适用于不同种类的微藻，包括常见的铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)和莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardti)。本专利技术在获得破碎藻悬液待测样品后，离心所述破碎藻悬液样品获得上清液。在本专利技术中，所述离心的转速优选的为10000～15000g，更优选的为11000～14000g；所述离心时间优选的为10～30min，更优选的为15～25min。本专利技术在获得所述上清液后，测定所述上清液在425～450nm或670～690nm波长处的吸光值Ax，根据测定的吸光值Ax与标准曲线计算微藻细胞破裂程度CDx。本专利技术中所述测定波长优选的为430～440nm或675～685nm。在本专利技术的实施例中，当微藻为铜绿微囊藻时，对应波长425～450nm处的标准曲线为CDt＝219.5At-0.6213b；对应波长670～690nm处的标准曲线为CDt＝355.19At+1.7192b；当所述微藻为莱茵衣藻时，对应波长425～450nm处的标准曲线为CDt＝129.04At+6.6205b；对应波长670～690nm处的标准曲线为CDt＝206.24At+7.4481b。在本专利技术中，所述标准曲线的获取方法包括：测定破碎藻悬液标样在所述波长处的吸光度值、采用计数法计算得到所述破碎藻悬液标样的破裂程度，根据所述破碎悬浮标样的吸光度值和破裂程度，线性拟合得到标准曲线。在本专利技术中，用于获取标准曲线的微藻标样为本领域常见的微藻细胞，例如蓝藻或绿藻，在本专利技术具体实施过程中优选的为铜绿微囊藻或莱茵衣藻。在本专利技术中所述微藻细胞优选的通过人工培养获得，在本专利技术中所述人工培养的方法采用本领域常规的微藻培养方法即可，无其他特殊要求，在具体实施过程中根据不同微藻种类对其培养基进行相应调整。在本专利技术中所述人工培养优选的在无菌光照培养箱中进行；所述人工培养的温度优选的为24～26℃，更优选的为25℃；所述人工培养的光照条件优选的为25～35μmolm-2s-1，更优选的为30μmolm-2s-1；所述人工培养的光暗比优选的为12h:12h。本专利技术中所述人工培养的时间没有特殊限定，优选培养至对数期的微藻细胞，因为对数期的细胞形态生理特征一致且活性强。本专利技术在人工培养微藻细胞至对数期后，固液分离微藻细胞培养液获得微藻细胞；本专利技术中所述固液分离优选方法为离心，所述离心的转速优选的为1800～2200g；更优选的为2000g；所述离心的时间优选的为3～8min，更优选的为5min。本专利技术为了得到破碎藻悬液标样，将微藻细胞与无菌水混合制备获得藻悬液。在本专利技术中所述微藻细胞与无菌水的混合比例以获得的藻悬液中的细胞浓度来确定；所述藻悬液中微藻细胞的浓度优选的103～107cells/mL，更优选的为104～106cells/mL。本专利技术在获得藻悬液后，为了获取不同破碎程本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测微藻细胞破裂程度的方法，包括以下步骤：1)制备破碎处理的藻悬液待测样品；2)离心所述破碎处理的藻悬液待测样品，获得上清液；3)测定所述步骤2)获得的上清液在425～450nm波长处的吸光度Ax或在670～690nm波长处的吸光值Ax’，根据预定的两处波长吸光度值对应的标准曲线计算得到待测样品的微藻细胞破裂程度CDx；所述标准曲线的获得方法为：测定破碎藻悬液标样在所述波长处的吸光度值、采用计数法计算得到所述破碎藻悬液标样的细胞破裂程度，根据所述破碎悬浮标样的吸光度值和细胞破裂程度，线性拟合得到标准曲线。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测微藻细胞破裂程度的方法，包括以下步骤：1)制备破碎处理的藻悬液待测样品；2)离心所述破碎处理的藻悬液待测样品，获得上清液；3)测定所述步骤2)获得的上清液在425～450nm波长处的吸光度Ax或在670～690nm波长处的吸光值Ax’，根据预定的两处波长吸光度值对应的标准曲线计算得到待测样品的微藻细胞破裂程度CDx；所述标准曲线的获得方法为：测定破碎藻悬液标样在所述波长处的吸光度值、采用计数法计算得到所述破碎藻悬液标样的细胞破裂程度，根据所述破碎悬浮标样的吸光度值和细胞破裂程度，线性拟合得到标准曲线。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述离心的转速为10000～15000g。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述离心时间为10～30min。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭啸，段志鹏，戴凯文，刘倩倩，舒筱倩，顾惠卉，
申请(专利权)人：河海大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32